| 研究課題/領域番号 |
06671003
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
平井 愛山 千葉大学, 医学部, 助手 (10189813)
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| 研究分担者 |
田原 和夫 千葉大学, 医学部・附属病院, 助手 (60241965)
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| キーワード | sterol carrier protein 2(SCP_2) / コレステロール / 泡沫細胞形成 / マクロファージ / 血管壁脂質沈着機構 / 動脈硬化症の成因 / 細胞内脂質転送蛋白 / 脱泡沫化 |
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| 研究概要 |
1.マクロファージの泡沫細胞化の過程におけるSCP_2の役割の解析
泡沫細胞形成におけるSCP_2の役割の解明を目的として、マクロファージの泡沫化の過程が細胞内脂質転送蛋白の増減によりどのように修飾されるかについて今年度は以下の検討を行った。
(1)SCP_2過剰発現細胞株の確立
マウスマクロファージ由来の培養細胞株であるJ774細胞を用いて、既にクローニングしたヒトおよびマウスのSCP_2の全長をコードするcDNAをメタルチオネインプロモーターにより誘導される発現ベクターへ組み込んだ。つぎにこの発現ベクターをJ774細胞に組み込み、現在細胞株の選択を行っている。
(2)ヒトおよびマウスのSCP_2蛋白とその特異抗体の調製および定量法の確立
既にクローニングしたヒトおよびマウスのSCP_2の全長をコードするcDNAをGSTとの融合蛋白として発現する大腸菌の発現ベクターに組み込みんだ。XL-1Blue細胞をもちいて、IPTG刺激によりヒトおよびマウスのSCP_2・GST融合蛋白を大量発現した。GST用のアフィニティーカラムによる精製およびトロンビンによるGSTからのSCP_2の切り出しおよびベンザミジンカラムによる精製を経て、単一バンドのヒトおよびマウスのSCP_2を精製した。この精製SCP_2を用いて、家兎を免疫し、抗血清を得たのち、精製SCP_2を用いたアフィニティーカラムにより、特異的ヒトおよびマウスSCP_2抗体を調製した。この特異抗体を用いたEIA(enzyme immunoassay)法によるヒトおよびマウスSCP_2の定量法も合わせて確立した。現在、上記のSCP_2過剰発現株の選択に用いている。
2.ヒト動脈硬化巣におけるSCP_2蛋白の局在およびその遺伝子発現の検討
ヒト動脈硬化症の血管組織を用いてSCP_2蛋白の分布とmRNAの解析を行ない健常部と病巣部での比較検討を行なうため、今年度は以下の実験を行った。
(1)ヒトSCP_2蛋白とその特異抗体の調製およびヒト組織での検出法の確立
上記の方法により、特異的抗ヒトSCP_2抗体を調製し、この特異抗体を用いたWesternblot解析によりヒト組織でのSCP_2の存在について、複数の組織を用いて現在基礎検討を行っている。
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