バゾプレシン遺伝子の発現とバゾプレシン前駆体蛋白の細胞内輸送に関する研究

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06671019
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 大磯 ユタカ 名古屋大学, 医学部, 講師 (40203707)
• 研究分担者: 有馬 寛 名古屋大学, 医学部, 医員 ; 湯浅 博光 名古屋大学, 医学部, 医員
• キーワード: バゾプレシン遺伝子 / 遺伝子変異 / 家族性中枢性尿崩症 / 遺伝子発現 / ニューロフィジン / 異常蛋白 / プロセシング障害

研究概要

今年度の研究は、先に確認した6家系の家族性中枢性尿崩症の遺伝子異常がどのようなメカニズムにより蛋白レベルの異常を発現するかについての検討を行った。バゾプレシン遺伝子上で確認された各種の異常を、ヒトバゾプレシンcDNAにsite directed mutagenesis法を用い導入した。この変異cDNAをexpressionvevtorであるpRcRCVに組み込んだ後、AtT-20細胞に導入しその発現を培養液中に分泌されるバゾプレシン量のRIA法により測定し、同時にルシフェラーゼの発現ベクターを導入し、cell lysateのルシフェラーゼ活性を測定することによりintemal controlとした。その結果、バゾプレシンの分泌量はニューロフィジン(NP)部分の変異では、wild typeの2〜20%と著明な低下を認めた。さらに,すべての家系の家族性中枢性尿崩症発症者がheterozygoteであることから、dominantnegative効果がみられるか否かを検討するため、各々の変異バゾプレシンcDNAと正常バゾプレシンcDNAを等量同時に導入したところ、いずれの変異もバゾプレシンの分泌は正常cDNAのみを導入したものに比べ低下はみられず、dominantnegative効果はないことが確認された。また、stable cloneを得た後、^<35>Cysでラベルを行い一定時間後に培養液と細胞についてNP抗体により経時的に免疫沈降を行った結果、いずれの変異においてもバゾプレシン前駆体蛋白のプロセシング効率の明らかな低下と、前駆体蛋白および異常NPの細胞内貯留が認められた。
以上により、バゾプレシン変異遺伝子発現機構の一部が明らかとなったが、今後さらにバゾプレシン合成・分泌機構におけるバゾプレシン前駆体蛋白の細胞内輸送との障害の発生についての解析を深めたい。

研究成果

• [文献書誌] Hiromitsu Yuasa et al.: "Novel mutations in the V2 vasopressin receptor gene in two pedigrees with congenital nephrogenic diabetes insipidus." J.Clin.Endocrinol.Metab.79. 361-365 (1994)
• [文献書誌] Hiroshi Nagasaki et al.: "Two novel mutations in the coding region for neurophysin-II associated with familial central diabetes insipidus." J.Clin.Endocrinol.Metab.80. 1352-1356 (1995)
• [文献書誌] Takashi Murase et al.: "The expression of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP)mRNA in rat brain:possible role of endogenous PACAP in vasopressin release." Neuroscience Letters. 185. 103-106 (1995)
• [文献書誌] 大磯ユタカ: "最近注目されている神経内分泌疾患:遺伝性尿崩症" ホルモンと臨床. 42. 1031-1036 (1994)
• [文献書誌] 大磯ユタカ: "分子内分泌学:ADH受容体異常症" ホルモンと臨床. 44. 79-83 (1996)
• [文献書誌] Yutaka Oiso et al.: "The Pituitary Gland,Second Edition" Raven Press,Ltd.,New Tork, 13 (1994)
• [文献書誌] 大磯ユタカほか: "臨床DNA診断法" 金原出版, 3 (1995)