好中球,血小板の大量培養法の開発と臨床応用への検討

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06671075
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 池淵 研二 東京大学, 医科学研究所・講師授 (20175194)
• 研究分担者: 浅野 茂隆 東京大学, 医科学研究所, 教授 (50134614)
• キーワード: 顆粒球 / 造血幹細胞 / 造血前駆細胞 / ストロマ細胞 / 大量培養 / 凍結保存

研究概要

ヒト造血幹細胞、前駆細胞を培養し大量の成熟顆粒球を産生する系を確立するため、まずヒト骨髄細胞を造血サイトカインの存在下で短期培養した。顆粒球の産生は一過性で培養系は容易に単球、マクロファージに置き換わり、造血前駆細胞の一部が生存するものの培養系全体が顆粒球になることは考えられなかった。骨髄ストロマ細胞と骨髄細胞の共培養系に顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)を添加したところ、浮遊培養系に現れてくる細胞の大部分が、造血前駆細胞、未熟骨髄系細胞、成熟顆粒球で占められることが判明した。培養は約2-3週間安定し、骨髄細胞1x10^6個から出発し、週2回の培養液交換の度に1x10^6個の成熟顆粒球が回収できる状態であった。系を大規模にするためにはヒト骨髄ストロマ細胞を大量に増殖させる必要があるため、培地にストロマ関連増殖因子を添加し培養を試みたが、EGF、FGF、IGFなどには血清成分に対する上乗せ効果はあるものの強力に増殖を誘導する働きが認められなかった。培養器具表面をコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどでコーティングし細胞増殖の支持を図ったが、細胞形態変化を誘導するものの決定的な増殖は認められなかった。ヒト造血を支持するマウス由来のストロマ細胞株を現在検討中である。
生体内でG-CSF刺激で大量に増幅した顆粒球を採取し、それらが体外で一定期間機能を有したまま生存維持できないが検討したが、顆粒球の体外での寿命は短い各種サイトカインを添加しても2-4日程度しか維持できなかった。顆粒球を凍結保存することの試みは、通常のDMSOを凍結保護剤として用いたプログラムフリージングでは失敗し、運動能を有する精子や卵子の凍結用保存液、冬眠昆虫の凍結予防体液組成を真似た保存液など考案し試みたが、十分な効果が今のところ得られていない。

研究成果

• [文献書誌] Takahashi,S: "Recombinant human glycosylated granulocyte colony-stimulating factor(rhG-CSF)-combined regimen for allogeneic bone marrow transplantation in refractory acute myeloid leukemia." Bone Marrow Transplantation. 13. 239-245 (1994)
• [文献書誌] Tani,K: "Retrovirus-mediated gene transfer of human pyruvate kinase(PK)cDNA into murine hematopoietic cells:Implication for gene therapy of human PK deficiency." Blood. in press.
• [文献書誌] Sui,X.: "gp130 and c-Kit signalings synergyze for ex vivo expansion of human primitive hemopoietic progenitor cells." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. in press.
• [文献書誌] 池淵研二: "遺伝子治療のための造血幹細胞の純化" 実験医学. 12. 71-76 (1994)
• [文献書誌] 池淵研二: "骨髄移植におけるG-CSFの新しい利用法" 日本輸血学会雑誌. 40. 516-518 (1994)
• [文献書誌] 池淵研二: "分別細胞移植法" 治療学. 28. 114-116 (1994)