| 研究課題/領域番号 |
06671716
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
川嵜 良明 大阪大学, 医学部, 助手 (00224767)
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| 研究分担者 |
河合 謙介 帝京大学, 医学部, 助手 (70260924)
土井 勝美 大阪大学, 医学部, 講師 (40243224)
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| キーワード | 虚血 / 内耳 / グルタミン酸レセプター / Glur / マイクロチュブール関連蛋白 / Map2 |
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| 研究概要 |
1)虚血モデル動物の作製
Korpatchev(1982)らの方法により成熟ラットを用いて虚血モデル動物を作製した。開胸後心臓より上行する血管を圧迫し2-3分間心臓停止の状態を負荷することで全脳虚血を作製した。完全な心臓停止5-6分後に心臓マッサージと人口呼吸器による強制換気により脳循環を再開させ、動物は自発呼吸を始めた動物はケージに戻された。
2)虚血モデル動物の内耳よりのmRNA抽出およびcDNAの作製
全脳虚血負荷後1-5日で動物を二酸化炭素ガスにて麻酔後断頭し中耳骨胞を摘出した。中耳骨胞より蝸牛を切り出して液体窒素中でホモゲナイズした後、GTC-CsTFA液中で超遠心分離にて内耳mRNAを抽出した。さらにmRNAから試験管内で逆転写酵素により相補的DNA(cDNA)を合成した。この際、虚血モデル動物の内耳と同様に正常動物の内耳よりもmRNAを抽出してcDNAを合成した。
虚血モデル動物の内耳cDNAのPCRによる増幅
脳でクローニングされたグルタミン酸受容体(AMPA型GIuR1-4;KA型GIuR5-7;NMDA型NMDAR1&2)およびマイクロチュブール関連蛋白(MAP2b&c)のcDNAの塩基配列よりそれぞれに特異的な合成オリゴプライマーを作製した。虚血モデル動物および正常動物それぞれの内耳cDNAをテンプレートにして、PCR(polymerase chain reaction)法によりこれらのcDNAを増幅し、得られたcDNAをアガロースゲルで分離回収した。cDNAをプラスミドベクターに挿入しダイ・プライマ法を用いてオートシークエンサーにて塩基配列を決定した。虚血モデル動物内耳に発現するグルタミン酸受容体(AMPA型GIuR1-4)では正常動物の内耳と同様に8種類のサブユニットの発現が確認された。GIuR2の発現量の変化について解析中である。マイクロチュブール関連蛋白(MAP2b&c)に関しては、虚血モデル動物内耳においてMAP2bと共にMAP2cの発現が強く認められた。すなわち、虚血モデル動物内耳においてこれらの蛋白質複合体に分子レベルでの構造的変化があると推察された。
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