| 研究概要 |
ベーチェット病患者由来Streptococcus sanguisから抽出した菌体DNAを制限酵素で切断ののち、λgt11ベクターにクローニングし、作成したライブラリーより、患者血清を一次抗体、抗ヒトIgGおよびIgM抗体を二次抗体とするイムノスクリーニングを行い、得た陽性クローンは、DNAとして約1.5kbpの大きさであり、Western blot法によりDNAの発現する蛋白は分子量33-35kDaであった。この得られたDNAの塩基配列の同定するため、まず単離したDNAのサブクローニングを行い、λgt11ベクターに入った菌体由来DNAを増幅後、EcoRIで切り出し、プラスミドpUC118に挿入し、この後、プライマー伸長法により、全塩基配列を決定した。その結果、1.5kbpの塩基配列の中にATGで始まるふたつのopen reading flame(ORF)と考えられる部分が存在しており、それぞれ590bpと950bpの大きさであった。Western blot法より抗原蛋白は分子量33kDa以上であったが、後者のORFはそのアミノ酸配列から推定して約34kDaの蛋白をコードしていると考えられ、また、16b上流にShine-Dalgarno配列を有していることから、後者のORFが抗原蛋白を発現している可能性が高いと考えられた。そこで下流領域をHindIIIおよびEcoRI CassetteおよびCassette primer^<【encircledR】>を用いたPCR法によってcloningし、さらに塩基配列の同定を行った。その結果、下流領域にstop codonが確認でき、抗原を発現していると考えられるopen reading frame(ORF)の全塩基配列が判明した。ORFは2,550bp、849のアミノ酸からなり、分子量は約94,800Daであった。Homology searchでは、ヒト網膜のganglion cellで発現しているhomeobox geneであるBrn-3bと高いhomologyがみられた。
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