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1 EGF(epidermal growth factor)による効果:ヒト顎下腺由来細胞株(HSG:human salivary gland adenocarcinoma cell line)において細胞増殖因子であるEGFは[^3H]thymidineのDNAへの取り込みを約1.5倍上昇させた。一方、HSG-AZA3(HSG親株を分化誘導剤の5-azacytidine処理によって得たcell line)では約3倍の増殖効果が認められ、EGFへの応答性が高いことを示した。そこでHSG-AZA3細胞におけるEGFの作用効果について検索した。EGFレセプター(EGFR)抗体を用いてウエスタンブロッティングをおこなったところ、約170kDの位置にレセプタータンパクを検出した。このバンドはEGF処理後に増強した。また、細胞から抽出したRNAを用いてRT-PCRを実施したところ、予想142bpのcDNA増幅バンドがEGF処理12時間後に最大となり、その後、減少した。
2 EGFR内在性チロシンキナーゼならびにMAPキナーゼ(MAPK)の検索:EGFRのチロシンリン酸化(自己リン酸化)を調べるためにウェスタンブロッティング分析を行った結果、EGF処理5分後に170kDaバンドのチロシンリン酸化を認めた。また、EGF処理はEGFR内在性チロシンキナーゼ活性を上昇させた。最近、MAPKを中心とするリン酸化カスケードが注目されている。そこでMAPKについてウェスタンブロッティング分析したところ、EGF処理後にリン酸化されたMAPK(活性型)のバンドが検出された。また、EGF刺激によりMAPK活性が上昇した。
3 細胞性ガン遺伝子(c-fosならびにc-myc)の検索:EGFはEGFRに結合すると細胞内に情報が伝達され細胞の増殖を促進し、核内転写制御因子であるc-fosやc-mycを誘導する。そこで、これら遺伝子の発現をタンパクレベルで調べるために特異抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果、EGF処理1-3時間後にc-fosタンパク質発現の増加を認めた。また移動度の遅延したバンドが見い出されたが、これは活性型MAPKによりリン酸化されたc-fosタンパク質と推測された。さらにc-fos mRNAレベルはEGF処理30分後に、c-myc mRNAの場合にはEGF処理2時間後に、急速に、そして一過性に上昇した。
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