| 研究課題/領域番号 |
06672149
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
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| 研究分担者 |
栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575)
黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204)
野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
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| キーワード | ジスルフィド結合 / 小ループS・S結合 / タンパク質のリフォールディング / タンパク質の折りたたみ / タンパク質の構造 / グルタチオン / サイトカイン |
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| 研究概要 |
組換えDNA法でタンパク質を大量生産するとき、製品が不活性な沈殿となって得られることが多い。そこで、これを一旦Guanidinium chloraide(GdmC1)でRandom coil状態とし、refoldする工程が必要となる。Refolding工程における技術的急所はタンパク質がaggregateして再び沈殿に戻るのを阻止するところにある。溶液中のタンパク質の濃度が高いと特にAggregatesが出やすい。一般に、タンパク質がその構造内にS-S結合を持つときにはRandom coil状態ではなく正しい3D構造にrefoldしてから近くに位置した2つのCysteinを酸化してS-S結合を形成するのが良い。このことはLysozymeなどで確認してある。しかし、いくつかの小ループS-S結合を構造内にもつCytokines等のタンパク質では、Random coil状態で酸化して、そのあとでrefoldする方法が良いことがある。それはS-S結合が小ループであるために、衝突頻度の関係からRandom coil状態で酸化しても正しいS-S結合を生成する率が高く、しかもS-S結合が形成されてからのRefoldingは全還元状態でのRefoldingに比べてAggregatesを生成しにくいからである。その結果溶液中のタンパク質濃度を高めることができ、工業的に能率がよい。しかし、この方法の欠点はタンパク質がmisfoldしてできた不純物の混在をさけられず、その分離を必要とすることである。
出来るならばRefolding溶液を工夫して、タンパク質の正しい形をつくってからS-S結合を形成したい。Aggregatesを生成しないLoose folding状態で正しいかたちに誘導しRelaxed native structureにもって行ければ、不純物を少なくして正しいRefoldingを達成できる。この両方法を定量的に比較することを目標として仕事は予定通り進行している。ただし、使用したタンパク質は研究計画・方法の項に記したG-CSFやProinsulin等でなく、G-CSFと同じく分子内に2つのS-S小ループを有し、純度の高いヒトInterleukin-6(IL-6)に変更した。この点を付記し、以上をもって報告とする。
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