| 研究課題/領域番号 |
06672173
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
石館 光三 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教授 (40014287)
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| 研究分担者 |
松尾 律子 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (00126260)
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| キーワード | コリンキナーゼ / エタノールアミンキナーゼ / ホスファチジルコリン / ホスファチジルエタノールアミン / cDNAクローニング / 遺伝子発現調節 / ホスホコリン / ホスホエタノールアミン |
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| 研究概要 |
最近、細胞の増殖刺激に対する細胞内情報伝達系において、DNA合成の亢進に先立ってコリン(エタノールアミン)キナーゼ(CK、EK)の活性上昇およびその反応産物であるホスホコリン(ホスホエタノールアミン)のプールサイズの増大が生ずる、という興味ある事実が種々の培養細胞実験系で明らかにされつつある。これらの現象はホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの生合成とは一見無関係に生じ、むしろ細胞増殖刺激時におけるセカンドメッセンジャー産生としての意義が注目されている。本研究では昨年度に引き続いて、ラット腎臓における主要なCK(EK)分子種である42 kDa CK(EK)のcDNAクローニングを検討した。手法としては、先ずラット腎より我々が開発した精製法に準じて純化した42 kDa CK(EK)をタンパク分解酵素処理ののち、生じた主要ペプチドを分離・分画し、その部分アミノ酸配列の情報をもとに数種の混合オリゴヌクレオチドプローブを作成した。これらのプローブ(3´-DIG ラベル)を用いて別途作成したラット腎cDNAライブラリー(lambda gt10)をプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングしたのち、陽性プラークについて2次スクリーニングを行い数種の陽性クローンを得た。PCR法によってcDNAインサートサイズを確認したのち、種々の制限酵素を用いてpUC18/19にサブクローニングし、PCRサイクルシークエンス法によりその塩基配列を解析した。現在までの時点で、プローブとして用いたオリゴヌクレオチドと100%マッチするcDNA塩基配列は得られておらず、なお検索を続けている状況である。また、既にそのcDNAのクローニングが成されたラット肝の主要CK(EK)および酵母CK(EK)の塩基配列に共通の部分をプローブとしたPCRクローニングも合わせて進行中であり、近い将来腎型CK(EK)のcDNAおよび遺伝子クローニングが成され、その一次構造の解析ならびに本遺伝子の臓器特異的な発現調節機構を明らかにすることが出来るものと考えている。
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