活性酸素生成に関与するB型シトクロム類の比較研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06672227
• 研究機関: (財)東京都臨床医学総合研究所
• 研究代表者: 三木 俊明 財団法人 東京都臨床医学総合研究所, 炎症研究部門, 研究員 (10239204)
• 研究分担者: 折井 豊 京都大学医学部, 助教授 (60028149) ; 藤井 博匡 都臨床研, 炎症研究部門, 研究員 (70209013)
• キーワード: 活性酸素 / スーパーオキシド / ミトコンドリア / 好中球 / B型シトクロム / NADPHラジカル / ESR

研究概要

NAD(P)Hを光励起すると、NAD(P)・ラジカルなど、非常に還元力の強い分子種が生成する。そこで好中球シトクロムb_<558>とセミキノンの反応のモデル系として、光励起NAD(P)Hの好中球シトクロムbに対する効果を調べた。嫌気条件下、NADPHを共存させ、単波長レーザー光(355nm)の閃光照射後に起こるシトクロムbのスペクトル変化を迅速反応測定装置を用いて記録した結果、NADPラジカルによるシトクロムb_<558>の還元は2次反応として進行し、その反応速度定数は4.3×10^8M^<-1>s^<-1>(pH7.4,20℃)と極めて大きいことが判明した。この結果は、NADPHラジカルが、シトクロムb_<558>のヘムの近傍まで接近することが可能であることを示唆している(Photochem.Photobiol.(1995)印刷中)。また、好中球シトクロムb_<558>のESRスペクトルに対するピリジンの効果を調べた結果、ピリジンの添加によりヘムの配位子がヒスチジンからシステインに変化し、シトクロムP450のヘムとよく似た環境になることが示された(JBC(1995)270:3193)。他方、ミトコンドリアにもエネルギー変換に関与するシトクロムbが存在する(JBC(1994)269:1827)。このシトクロムとNADPHラジカルとの反応を検討した結果、ミトコンドリアシトクロムbではNADPHラジカルによる還元はほとんど進行せず、好中球シトクロムb_<558>とは異なるヘムの存在状態が示唆された。好中球のNADPH依存性フラビン酵素の精製を試みた結果、この酵素はいずれのNAD(P)Hに対するアフィニティカラムにも吸着せず、非常に珍しいタイプのフラビン酵素であることがわかった。このフラビン酵素の部分精製標品と精製シトクロムb_<558>を組み合わせて、分光学的解析が可能な活性酸素生成系を再構成する事ができた。この再構成系の解析から活性酸素生成機構に関し、知見が得られることが今後期待される。

研究成果

• [文献書誌] Toshiaki Miki: "Membrane potential-linked Reversed Electron Transfer in the Beef Heart Cytochrome bc_1 Complex Reconstituted into Potassium-loaded Phospholipid Vesicles." Journal of Biological Chemistry. 269. 1827-1833 (1994)
• [文献書誌] 三木俊明: "白血球のNADPH Oxidase系の活性酸素生成機序" 活性酸素・フリーラジカル. 6. 23-29 (1995)
• [文献書誌] Hirotada Fujii: "Modulation of the Heme Enviroment of Neutrophil Cytochrome b_<558> to a“Cytochrome P450-like"Structure by Pyridine." Journal of Biological Chemistry. 270. 3193-3196 (1995)
• [文献書誌] 藤井,博匡: "EPR Studies on Pyridine-induced Heme Enviroment of Neutrophil Cytochrome b_<558>" 磁気共鳴と医学. 6. 202-204 (1995)
• [文献書誌] Yutaka Orii: "Kinetic Characterization of the Redox Components in Solubilized Membranes from Porcine Neutrophils" Photochemistry and Photobiology. 印刷中.
• [文献書誌] Yutaka Orii: "Facilitated Intramolecular Electron Transfer in the Escherichia coli bo-type Ubiquinol Oxidase Requires Chloride." Biochemistry. 34. 1127-1132 (1995)
• [文献書誌] 三木俊明: "タンパク質化学第4巻" 広川書店(野崎光洋,折井豊,指吸俊次編)(印刷中),