キャピラリーHPLC/エレクトロスプレーイオン化質量分析による微量蛋白質構造解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06680584
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 高尾 敏文 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (10197048)
• キーワード: キャピラリーHPLC / 微量試量 / エレクトロスプレーイオン化 / イオン化効率 / 質量分析 / 分子量測定 / 蛋白質のブロッティング / 疎水性膜

研究概要

キャピラリーHPLC/エレクトロスプレーイオン化質量分析による微量蛋白質構造解析法を確立するために、キャピラリーHPLC、タンデム質量分析計及びマイクロブロットコーダーを接続、統合した.キャピラリーHPLCでの分離、マイクロブロットコーダー(平成6年度備品)上でのHPLC溶出液のブロッティング、質量分析におけるイオン化効率等の微量試料を分析するための諸条件を検討した。その結果、HPLCでの分離は流速3μl/分、また、溶媒としてはアセトニトリル/TFA系、質量分析計におけるイオン化のための添加溶媒としては1.2μl/分の流速で、2-メトキシエタノール/イソプロパノール/メタノール(1:1:1)の混合溶媒が最適であることが分かった.また、質量分析計への導入と同時にHPLCからの溶出液をT型スプリッターによって、1:1のスプリット比でマイクロブロットコーダーに分配し、試料の一部を高収率で疎水性膜上に回収することができた.上記装置を既知試料に応用した結果、キャピラリーHPLC/エレクトロスプレーイオン化質量分析によるペプチド、蛋白質の分子量測定では、検出限界2pmolという微量で、磁場性質量分析計としては初めてLC/MSとしてオンライン分析が可能となり、誤差0.01%以下の精度よい測定が達成された.また、マイクロブロットコーダーによる試料の回収率は90%以上で、さらに、疎水性膜上にブロットされた微量蛋白質(約10pmol)のアミノ酸配列分析が行えることがわかった.本方法を用いて、植物由来のフェレドキシン、グルタミン合成酵素に見いだされた4種のアイソザイム、並びにそれらの大腸菌による遺伝子組み換え蛋白質の一次構造の同定を行った.

研究成果

• [文献書誌] Yoshino,K.: "Purification and Characterization of a Novel Superantigen Produced by a Clinical Isolate of Yersinia pseudotuberculosis." FEBS Lett.356. 141-144 (1994)
• [文献書誌] Takao,T.: "Positive-Ion Fast Atom Bombardment Tandem Mass Spectrometry of Peptide Nucleic Acids." Rapid Commun.Mass Spectrom.8. 925-928 (1994)
• [文献書誌] Matsuda,T.: "Characterization of Interactions between Transducin α/Br-Subunits and Lipid Membrans." J.Biol.Chem. 269. 30358-30363 (1994)
• [文献書誌] Agawara,K.: "Activation Peptide of Human Factor IX Has Oligosaccharides O-Glycosidically Linked to Threonine residues at 159 and 169" Biochemistry. 33. 5167-5171 (1994)
• [文献書誌] Murata,H.: "Optimization of Skimmer Voltages of an Electrospray Ion Source Coupled with a Magnetic Sector Instrument." Rapid Commun.Mass Spectrom.8. 205-210 (1994)
• [文献書誌] Fukada,Y.: "Effects of Carboxyl Methylation of Photoreceptor G Protein γ-Subunit in Visual Transducin." Biol.Chem.269. 5163-5170 (1994)