キャピラリーHPLC/エレクトロスプレーイオン化質量分析による微量蛋白質構造解析

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06680584
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 高尾 敏文 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (10197048)
• キーワード: キャピラリーHPLC / エレクトロスプレーイオン化 / 質量分析 / 遺伝子組み換え蛋白質 / 蛋白質の一次構造解析 / 安定同位体 / カルボキシ末端ペプチド / 疎水性膜

研究概要

キャピラリーHPLC/エレクトロスプレーイオン化質量分析による微量蛋白質構造解析法を確立するために、平成6年度に諸々の条件検討を行うことにより構築したキャピラリーHPLC、タンデム質量分析計、及びマイクロブロットコーダーの組み合わせを平成7年度研究計画に基づいて、種々の蛋白質の一次構造解析に応用し、評価した。以下にその成果を列挙する。
1)種々の遺伝子組み換え蛋白質の同定に応用した結果、大腸菌で発現された人インターフェロン、及び、発熱連鎖球菌から新たに単離された蛋白質の遺伝子組み換え産物において幾つかの修飾様式を見いだした。また、これらの実験から、通常の方法では同定が困難な目的蛋白質の最終精製標品中に存在する不純物等の微量成分の検出に本方法が有効であることを示すことができた。
2)酵素による安定同位体^<18>O(H_2^<18>Oを^<18>O源として使用)標識化により、蛋白質カルボキシ末端ペプチドの同定が可能であることを確かめた。
3)人スーパーオキシドディスミュターゼにおいて、グルタチオンによる酸化的修飾が分子中の111番目のシステイン残基で特異的に起きることが明らかとなった。
4)マイクロブロットコーダー(平成6年度設備備品)において、キャピラリーHPLCから溶出する液がより効率よく疎水性膜上に吸着するように、液がしみ出すニードル先端の動きを従来の直線からジグザグ方式に改良した。それにより、溶出液の浸潤効率が向上すると同時に、当初の装置において問題であった近接する画分間のクロスコンタミネーションが解消した。

研究成果

• [文献書誌] Yoshino,K.: "Use of the Derivatizing Agent,4-Aminobenzoic Acid 2-(Diethylamino) ethyl Ester for High-Sensitivity Detection of Oligosaccharides by Etectrospray Ioniation Mass Spectrometry." Anal.Chem.67. 4028-4031 (1995)
• [文献書誌] Imamoto,N.: "In Vivo Evidence for Involvement of a 58 kDa Component of Nuclear Pore-Targeting Complex in Nuclear Protein Import." EMBO,J.14. 3617-3626 (1995)
• [文献書誌] Imamoto,N.: "The Nuclear Pore-Targeting Complex Binds to Nuclear Pores after Association with a Karyophile." FEBS Lett.368. 415-419 (1995)
• [文献書誌] Sanada,K.: "Role of Heterogeneous N-Terminal Acylation of Recoverin in Rhodopsin Phosphorylation." J.Biol.Chem.270. 15459-15462 (1995)
• [文献書誌] Daquinag,A.C.: "Primary Structure of a Novel Potent Endogenous DOPA-Containing Inhibitor of Phenoloxidase from Musca domestica." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92. 2964-2968 (1995)
• [文献書誌] Murata,H.: "Capillary Liquid Chromatography/Electrospray Mass Spectrometry with a Magnetic Sector Instrument for Accurate Mass Measurement of Peptide and Protein Mixtures." Elsevier (NewYork). 267-280 (1995)