| 研究概要 |
補酵素結合部位を弧状に取り巻きPLPと水素結合する残基間のネットワーク(PLP-N1,Asp222,His143,Thr139,His189,Ser136,His193,Asn194,Tyr225,PLP-03')の一部を構成するHisクラスターが共同して活性域内荷電状態の安定性を保ち、シッフ塩基の反応性を増加している可能性を明らかにするため、ブタ酵素変異体を作成し、変異酵素の諸性質を野性型酵素と比較検討した。
1.His143,His189,His193をそれぞれ、最も構造的に近いが荷電を持たないGlnに置換した変異酵素を作成した。
2.変異酵素の動力学的性質を野性型酵素のそれと比較したところ、基質に対する親和性を若干減少していたが、反応速度に変化は見られず、触媒活性に大きな差異は観察されなかった。
3.変異酵素の吸収およびCDスペクトルを解析し、補酵素PLP結合に関する情報を得た。His189をGlnに置換した酵素では、シッフ塩基のpK値が大きく上昇していたが、他の変異酵素は野生型酵素と同様の吸収スペクトルを示した。
4.変異酵素のNMRスペクトルを解析し、野性型酵素におけるHis189ピークの帰属を決定した。His189に由来するシグナルは、pHによる化学シフト変化をほとんど示さなかった。His143Gln,His193Gln変異酵素におけるHis189の化学シフト位置が野生型酵素のそれと異なることから、3つのHis残基間に相互作用があると考えられた。
5.米国Arnone,Metzler研究室と共同でX線による変異酵素の全体構造の解析を行なっている。
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