| 研究概要 |
本年度は本研究において中心的な役割を果たすストップトフローカロリメータ装置の改良とキモトリプシン反応の解析を主として行った.研究代表者が開発したストップトフロー装置には(1)観測室の耐久性,(2)混合前試料の保存,(3)熱損失の補正などの解決すべき問題があった.(1)に関しては,センサー装着時に用いる接着剤の選択,接着後のキュアリングを注意深く行うことによって,センサーの寿命まで使用可能時間を延長できるようになった.(2)については,溶液駆動用シリンジと溶液溜を収納する保冷ボックスを設計し,酵素の失活や反応前の基質の分解を最小限にできる見通しがついた.熱測定では不可欠の(3)に関しては,実時間補正のコンピュータプログラムの開発を試みた.しかし,サンプリングの進行と共に,処理速度の遅延が顕著となり,新しいアルゴリズムを考案する必要のあることが明かとなった.
キモトリプシン反応過程における(1)酵素と基質の結合,(2)酵素のアシル化,(3)酵素の脱アシル化において,以前は過程(1)+(2)は吸熱,過程(3)は発熱であると推定されているにすぎなかったが,本年度の研究によって,(1)は発熱,(2)は吸熱反応であることが明かとなった.さらに,(1)はフローストップ以前に完了する速い反応であり,正確な熱測定は困難であるが,van't Hoff解析によって,反応熱評価が可能であることから,(1)と(2)の反応熱を別々に評価することが可能となった.この結果,キモトリプシン触媒反応の主要な中間過程の熱力学的考察,エンタルピーとエントロピー寄与の見積が可能となり,コンフォメーション解析の知見と併せて同反応の機構のより深い洞察が行えるようになったと考えられる.
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