活性持続型ビタミンCによる組織形成誘導機構の研究-ビタミンC応答配列の解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06680678
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 畑 隆一郎 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (10014276)
• 研究分担者: 妹尾 春樹 秋田大学, 医学部, 教授 (90171355) ; 堀川 三郎 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (10127136)
• キーワード: 活性持続型ビタミンC / 組織形成 / コラーゲン / 転写制御

研究概要

活性持続型ビタミンC(Asc2-P)の組織形成誘導機構の解析過程に、Asc2-PはI型コラーゲンの合成を特異的に活性化し、かつ、de novoの蛋白質合成を必要としない遺伝子の転写レベルの活性化であることが明らかになった。そこで,Asc2-PによるI型コラーゲンのα1(I)鎖、およびα2(I)鎖遺伝子の転写活性化に関与する応答配列を解析した。それぞれの遺伝子の上流-500bpから第一エキソンの非翻訳領域(+120あるいは+138bpまで)をPCR法で増幅し、この領域をルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とするベクターに挿入したコンストラクト、pGVBα1(I)(0.6k)、およびpGVBα2(I)(0.6k)を作製した。制限地図および塩基配列の決定により、目的の生成物であることを確認後、リポソーム(ジーントランスファー)を用いてヒト皮膚繊維芽細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性が最大を示す条件を決定した。この条件でレポーター遺伝子をトランスフェクトした後、さらにAsc2-P存在下、あるいは非存在下で培養後、ルシフェラーゼ活性の発現を測定したが、Asc2-Pの添加に関係なく同じ活性を示したので、この領域には応答配列は存在しないと考えられた。ついで、さらに広い領域を調べるためにα1(I)鎖、α2(I)鎖遺伝子、およびそれぞれの上流領域を含むCharon4Aベクター(RMS8およびNJ13)のインサートをpB1uescriptIIを用いてサブクローニングし、遺伝子の上流から第一イントロンを含むレポーター遺伝子pGVBα1(I)(2.2k)およびpGVBα1(I)(4.0k)を作製し、上記と同様にトランスフェクトし、培養したが、Asc2-Pの添加の有無にかかわらず発現活性は低かった。これらのベクターのインサートにはコラーゲンα1(I)鎖あるいはα2(I)鎖の翻訳開始コドンを含むため、ルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が阻害され、発現活性が低いと考えられた。現在、遺伝子の上流と第一イントロンの領域を別々に挿入したレポーター遺伝子を作製し応答配列を決定中である。

研究成果

• [文献書誌] Haruki Senoo: "Extracellular matrix regulates and L-ascorbic acid 2-phosphate further modulates morphology,proliferation,and collagen synthesis of sinusoidal stellate cells." Biochem.Biophys.Res.Commun.200. 999-1006 (1994)
• [文献書誌] 山口典子: "コラーゲンの多様性と機能" 臨床検査. 38. 771-779 (1994)
• [文献書誌] 妹尾春樹: "星細胞(ビタミンA貯蔵細胞)の細胞生物学" ビタミン. 68. 501-513 (1994)
• [文献書誌] 妹尾春樹: "細胞外基質とその受容体" 腎と透析. 37. 1067-1074 (1994)
• [文献書誌] Haruki Senoo: "Extracellular matrix regulates cell morphologh,proliferation. and tissue formation." Acta Anat.Nippon.69. 719-733 (1994)
• [文献書誌] 畑隆一郎: "活性持続型ビタミンC(L-アスコルビン酸2ーリン酸)を用いたビタミンCの新しい生理作用の研究" 組織培養. 21. 106-109 (1995)
• [文献書誌] Ryu-Ichiro Hata: "Pathogenesis and Management of Scleroderma and Connective Tissue Disorders" Scleroderma Research Committee, 145 (1994)
• [文献書誌] Haruki Senoo: "Cells of the Hepatic Sinusoid" Kupffer Cell Foundation(in press), (1995)