| 研究概要 |
本年はCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子を持つミニレプリコンをin vitroで作製し、ミニレプリコンの複製をCAT活性を指標として追跡することを試みた。残念ながら現在までのところ有意なCAT活性を検出するに至っていないが本年度の結果は以下のとおりである。ミニレプリコンの複製は2つの方法で試みた。ひとつはRNA transfection法でムンプスウイルス5',3'非翻訳領域のあいだにCAT遺伝子を含むcDNAを構築しT7RNAポリメラーゼによりin vitroでRNAを合成しムンプスウィルス感染細胞にRNAをtransfectionした後CAT活性を測定するという方法である。なおcDNAはCAT遺伝子フラグメントを基にしてオリゴヌクレオチドとPCR法を用いて構築し、塩基配列は全て確認した。最初T7RNAポリメラーゼでRNAを合成することができなかったがこの問題はApCをプライマーとして反応系に加えることにより解決した。RNAをtransfectionする方法としてはLipofectAMINE,LipofectACE,Lipofectin,DEAE-Dextran等を用いた。RNAはマイナス鎖、プラス鎖両方をttransfectionに供してみた。細胞もCos7、MDBK、293などを用いてみた。2つめの方法はワクチニアーT7ハイブリッド発現システムを用いる方法で、ムンプスウイルスのL,P,NPタンパク質をcDNAから発現させると同時にミニレプリコンもT7RNAポリメラーゼを用いて細胞内で合成するという方法である。3'末端を正確に切断するためにHDVリボザイムを用いた。CAT活性を検出できない原因は不明であるがcopy-backタイプのDIRNAを用いてL,P,NPタンパク質の活性を確認する必要があるとおもわれる。
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