IL-8受容体染色体DNAの解析およびIL-8受容体遺伝子欠損マウスの作製

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06770239
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 原田 明久 金沢大学, 医学部, 助手 (00228636)
• キーワード: インターロイキン / IL-8 / 受容体 / cDNAライブラリー / GST fusion protien / RT-PCR / トランスフェクション / MIP-2

研究概要

好中球走化因子であるインターロイキン8(IL-8)の受容体はC5a受容体やfMLP受容体同様、7つの細胞膜貫通ドメインを持つG蛋白質結合性受容体ファミリーに属する。アミノ酸レベルではヒトIL-8受容体タイプIとタイプIIは77%の相同性を有し、ヒトIL-8受容体とウサギIL-8受容体は84%の相同性を有する。この高い相同性を有する塩基配列を利用し、よく保存されている領域の塩基配列をもとに作成したプライマーを用い、マウス末梢血好中球mRNAを鋳型としてRT-PCRを行ったところ約700bpのDNAフラグメントが増幅された。次にこれをプローブとして用い、マウスIL-3依存性白血病細胞cDNAライブラリーをスクリーニングする事より7つのクローンを得たがいずれも同様の塩基配列を示した。得られたクローンは全長1873bpで359アミノ酸をコードしヒトIL-8受容体タイプIとタイプIIとそれぞれ64%、69%のホモロジーがある一方、ヒトC5aおよびfMLP受容体に対してはそれぞれ15%以下のホモロジーしか認められなかったことからこのcDNAのコードするタンパクはmIL-8Rと考えられた。
このマウスIL-8受容体をGSTとともに発現したGST fusion protien を作製し、これをウサギに免疫して坑mIL-8R抗体を得た。マウスIL-8受容体をトランスフェクションしたCHO細胞を用い、ヨードラベルしたヒトIL-8の結合を検討したところ、この抗体は特異的に結合を阻害した。さらに、骨髄中の好中球を用いてFACSを行ったところ、この抗体はIL-8受容体を発現している好中球を認識出来ることがわかった。さらに同様の骨髄好中球を用いた実験においてヨードラベルしたマウスMIP-2は、coldのマウスMIP-2にては完全に結合が阻害され、坑mIL-8R抗体を用いると約50%阻害されたが一方でヒトIL-8にては弱い結合阻害しか認めなかった。このことはIL-8はゲッシ類においてはモルモットには存在し、ラット、マウスにおいては存在しないとされているが、今回われわれが得たマウスIL-8受容体は、マウスMIP-2をリガンドの一つとしていることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Wada,T.: "Prevention of proteinuria in acute immune complex-mediated glomerulonephritis by an antibody against interleukin 8." J.Exp.Med.180. 1135-1140 (1994)
• [文献書誌] Akahoshi,T.: "Essential involvement of interleukin-8 in nerutrophil recruitment in rabbits with acute experimental arthritis induced by lipopolysaccharide and interleukin-1." Lymphpokine Cytokine Res.13. 113-116 (1994)
• [文献書誌] Harada,A.: "Cloning of a cDNA encoding a mouse homolog of the interleukin-8 receptor." Gene. 142. 297-300 (1994)
• [文献書誌] Harada,A.: "Essential involvement of interleukin8(IL 8) in acute inflammation." J.Leukocyte Biology. 56. 559-564 (1994)
• [文献書誌] Mukaida,N.: "Cytokines:interleukins and their receptors." A novel leukocyte chemotactic and activating cytokine,interleukin 8(IL-8).(in press), (1995)
• [文献書誌] Harada,A.: "Challenges of Modern Medicine" Molecular analysis of the transcriptional reguation of the IL 8 gene and establishment of essential roles of IL 8 in acute inflammation., 6 (1994)