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本申請では、植物の光受容蛋白質であるA型フィトクロムの結晶化を主たる目標として研究を遂行した。
試料には、純度の高い標品を得ることのできるアラスカエンドウA型フィトクロムを使用した。このA型フィトクロムは分子量114kDaのポリペプチドの二量体として存在する。今回の結晶化では、その二量体と二量体をトリプシン分解して得られる発色団ドメイン(分子量59kDa)を使用した。
まず、いずれの試料についても300種類の結晶化用沈殿剤溶液を準備し、ハンギングドロップ蒸気拡散法により、初期的な結晶化条件の探索を行った。A型フィトクロムは、生体内での存在量が非常に少ないてめ、ハンギングドロップには0.7μlのA型フィトクロム溶液を使用し、少ない試料でより多くの条件探索を行うことを心がけた。
1)発色団ドメインの結晶化
発色団ドメインは二量体のトリプシン処理によって得られるが、極微小量のトリプシンが処理後混在しており、1ヵ月以上を要する結晶化条件探索の期間中に発色団ドメインが更に分解されることが判明した。現在、トリプシンの標品からの完全な除去方法を検討中である。
2)二量体の結晶化
結晶化条件探索の結果、A型フィトクロム二量体は臨界ミセル濃度以下の界面活性剤やグリセリン存在下で結晶化が可能であることが判明した。沈殿剤には、ポリエチレングリコール、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムが有効であり、pHは7以上であることが不可欠であった。いずれの場合にも、得られる結晶は25μm程度の太さの棒状結晶であるため、実験室でのX線回折実験では、結晶の空間群を同定できるほどの回折斑点が十分に観察されていない。今後は、結晶学的研究に耐えうる結晶成長条件を探索する予定である。
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