|
最初に8-ヒドロキシグアニン(8-OHG)を含むDNA断片を高収率かつ簡便に合成可能な新規ホスホロアミダイト体を化学合成した。これをビルディングブロックとして用い、DNA自動合成機を用いて8-OHGを含むオリゴヌクレオチドを合成し、HPLCを用いて高純度に精製した。次にオリゴヌクレオチドを酵素的に連結させ、鋳型DNAを調整した。
3'-末端にミスマッチを含むプライマーと鋳型DNAをアニーリングさせ、哺乳動物細胞から調整したDNAポリメラーゼαを用いて、DNA鎖伸長反応を行った。電気泳動を用いて分析したところ、G:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によってはG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。一方、8-OHGの場合には、8-OHG:C、8-OHG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によっては8-OHG:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。
以上の結果を、同一配列を用いて測定した熱力学的安定性と比較したところ、予想とは異なり、Gの場合にも8-OHGの場合にも、DNAポリメラーゼαによる伸長と熱力学的安定性には直接的な相関関係がないことが明らかとなった。
以上、本研究で得られた結果から、DNAポリメラーゼの塩基対伸長反応には、熱力学的安定性によって、一義的に決定しているのではなく、他の要因(例えば、塩基対の形やDNAポリメラーゼとの親和性)による影響が大きいことが明らかとなった。
|
