|
RbはE2F、MyoD、Myogeninなどの転写因子複合体中に検出でき、CATアッセイなどにより転写活性がRbの発現により変化することから転写因子制御であると推定されている。しかし、Rbのリン酸化がDNA合成期を通じて起こっていることから、Rbが転写因子の制御だけでなくDNA複製に直接関与している可能性が推定される。Rbが複製に直接関与していることかどうかを検討し、癌抑制遺伝子の不活化による癌化機構の解明を行う目的で研究を行った。
c-mycのプロモーター領域にはDNA複製起点の存在が推定されている。Rbが欠損または発現させた細胞に、DNA複製起点複製領域を含むプラスミドをトランスフェクションにした。その結果、Rbを発現させた細胞では、Rbが欠失した細胞にベプラスミドのコピー数が減少した。しかし複製起点を含まないプラスミドは影響を受けなかった。この結果が複製による結果であることを明らかにするため、メチル化により制限酵素切断にたいして耐性にしたプラスミドをトランスフェクションし、複製された結果生じたメチル化されていないプラスミドを検出し、Rb発現による影響を検討した。その結果Rbが発現している細胞では複製していないプラスミドが多く検出され、一方、Rbが発現していない細胞では複製したプラスミドが多く認められた。したがって、Rbは複製速度に影響を与えることを示している。
RbがDNA複製に関与する直接的な証拠を得るため、Rbの免疫沈降複合体にヘリケース活性やDNAポリメラーゼ活性などがないか検討した。Rbを含む細胞抽出液からRbの免疫沈降複合体を調整し、c-mycプロモーター領域を含むプラスミドを入れ、ヘリケース活性、DNAポリメラーゼを検討したが、cdk/サイクリンAでリン酸化させてRbを不活性化させた場合でもこれらの活性は認められなかった。これまで高等動物で開発されているin vitroの完全複製系はSV40複製起点だけである。この系はLT抗原依存性で、LTはRbの機能を抑制するために本研究においては不適当である。今後、Rbの複製への関与が直接示す目的でLT以外の複製系の開発が期待される。
|
