| 研究課題/領域番号 |
06807068
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
高橋 勇二 東京薬科大学, 生命科学部・環境生命科学科, 助教授 (20154875)
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| 研究分担者 |
三浦 卓 東京薬科大学, 生命科学部・環境生命科学科, 教授 (70013323)
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| キーワード | 酸素刺激 / ラット / 新生仔 / 肺 / RT-PCR / Differential Display |
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| 研究概要 |
動物実験は、時間経過による個体発達に依存した変化と、酸素刺激によってもたらされる変化とを判別し難い。この危険を回避するため、本実験では、ラット新生仔肺上皮由来の株化細胞、胎性末期の胎仔ラット肺から分離した間充織細胞、および、上皮細胞を用いた。そして、本研究の目的が「酸素刺激によって量的に変化する調節遺伝子の検索」であるので、酸素刺激1〜16時間後の培養細胞を材料とした。
細胞培養条件の検討
新生仔ラット(10日齢)の肺から肺胞上皮2型細胞を分離しSV40によってトランスフォームした不死化細胞(SV40T2)を調整した。胎性末期のラット胎仔肺から分離した間充織細胞、および、SV40T2を培養し、各種酸素濃度下における増殖率及び培養液中へのLDH漏出試験を行った。間充織細胞は、1%という低酸素分圧かで、21%酸素分圧との同様の増殖率を示した。3%酸素分圧かでは21%酸素分圧に比較し20%高い細胞増殖率を示した。SV40T2細胞は1%酸素分圧で、培養2日目で増殖をほぼ停止した。
RT-Differential Display法を用いた遺伝子の検索
3%酸素に1カ月間以上順化した間充織細胞を21%酸素環境下に培養開始後、1及び16時間後の細胞より全RNAを抽出した。RT-PCR法を応用したRT-Differential Display(RT-DD)法を用いて酸素分圧変化によって特異的に増加する遺伝子を検索した。T12AMとAP6のプライマーの組合せにより21%酸素暴露開始1時間目に特異的に現れるバンドが認められた。現在cDNAのクローニングを進行中である。
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