分子状酸素の一電子還元を触媒するb型シトクロームの構造と機能

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06808067
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 磯貝 泰弘 理化学研究所, 生体物理化学研究室, 研究員 (00201921)
• 研究分担者: 飯塚 哲太郎 生体物理化学研究室, 主任研究員 (30029475)
• キーワード: 活性酸素 / 電子移動 / ヘムタンパク質 / 食細胞

研究概要

1.食細胞のシトクロームb_<558>は、分子状酸素を活性化するほかのヘム酵素とは異なり、6配位型のヘム鉄を活性中心にもつことから、その反応のメカニズム興味がもたれた。そこで私はブタ好中球から精製したシトクロームb_<558>とO_2との反応をストップトフロー・ラピッドスキャン法を用いて解析した。O_2による還元型シトクロームの再酸化に伴うスペクトル変化に、明らかな等吸収点が観測された。この等吸収点は、嫌気条件下でのジチオナイトによる還元反応で観測されたものと一致した。反応速度はO_2濃度に依存し、一酸化炭素の添加によって全く影響を受けなかった。速度定数のpH依存性を調べたところ、pH>9で減少し、pKa=9.7を得た。また、熱力学的解析によって、反応の活性化パラメーターを求め、ほかのヘムタンパク質の反応と比較した結果、シトクロームb_<558>とO_2との反応は、明らかに内圏型の電子移動反応とは異なっていた。以上の結果、シトクロームb_<558>によるO_2の還元は、O_2とヘム鉄との共有結合を介さない外圏型の電子移動反応によるものであることが強く示唆された。
2.構造解析に向けてシトクロームb_<558>の大量精製法を確立した。
3.分化型ヒト白血病細胞を食細胞のモデルとして用い、刺激剤をコートした超微小電極を用いて単一細胞に点刺激を与え、その後のスーパーオキシドの生成の時間変化と細胞の形態変化を同時測定することに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Isogai,Y.: "The mechanism of electron donation to molecula oxygen by phagocytic cytochrone b558" Journal of Biological Chemistry. (印刷中). (1995)
• [文献書誌] 磯貝泰弘: "生体防御系のヘム蛋白質、食細胞のb型シトクロームによるスーパーオキシド生成機構の解析" 生物物理. 34. 23-29 (1994)
• [文献書誌] 津山友美: "カーボン微小電極を用いたスーパーオキシドアニオンラジカル(O_2)の電気化学的検出、培養細胞(HL60細胞)への応用" 電気化学および工業物理化学. 62. 959-962 (1994)
• [文献書誌] Iwasaki,T.: "Functional and evolutionaly implications of a [3Fe・4S]cluster of the dicluster type ferredoxin from the thermoacidophilic Archaeon,sulfolobus sp." Journal of Biological Chemistry. 269. 29444-29450 (1994)
• [文献書誌] Isogai,Y.: "A mechanism of superoxide production catalyzed by phagacytic cytochrome b558" Frontiers of reactive oxygen species in biology and medicine. 49-50 (1994)
• [文献書誌] Tanaka,K.: "Electrochemical determination of superoxide anions generated from a single cell" Frontiers of reactive oxygen species in biology and medicine. 89-90 (1994)