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研究計画における、第二年度の中心的テーマは、第一年度に同定したシス制御配列(Rax CNS1)とトランス作動性因子(Otx2及びSox2)のin vivoの機能の調査であった。私は、Otx2及びSox2がRaxCNS1にin vivoで結合するかを調べるため、ツメガエル胚を用いてクロマチン免疫沈降を試みた。まず、第一段階として、エピトープタグを付加したOtx2及びSox2を発現するmRNAをツメガエル受精卵に微量注入し、胞胚後期まで培養したのちに、タグに対する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、PCR解析を行った。その結果、PCRによりRax CNS1が特異的に増幅されたことから、過剰発現したOtx2及びSox2がRax CNS1こin vivoで結合しうることが明らかになった。さらに、内在性のOtx2及びSox2がRax CNS1に結合しているかを調べるため、過剰発現を行わずに、Otx2およびSox2に対する抗体を用いて、クロマチン免疫沈降を行った。その結果、神経胚において、内在性のOtx2及びSox2がRax CNS1に特異的に結合していることが明らかとなった。
また私は、トランス作動性因子Sox2のin vivoの機能を調査するため、支配的抑制変異Sox2をツメガエル胚に発現させた。支配的抑制変異Sox2のmRNAをツメガエル胚に微量注入すると、神経胚において、Raxの発現が低下することが観察された。また、アニマルキャップを用いたRT-PCRにおいて、Otx2の過剰発現によってRaxの発現は誘導されるが、その発現誘導は、支配的抑制Sox2の微量注入によって抑制されたことから、in vivoにおけるRaxの発現には、Otx2とSox2の両方が必要であることが示唆された。
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