酵母におけるペルオキシソーム膜蛋白質の機能とソーティング

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07044196
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 加藤 暢夫 京都大学, 農学部, 教授 (50026556)
• 研究分担者: 由里本 博也 京都大学, 農学部, 助手 (00283648) ; グッドマン ジョエル・M テキサス大学, サウスウエスタン医学センター, 助教授
• キーワード: Candida boidinii / Saccharomyces cerevisiae / peroxisome / Pmp30 / Pmp27 / Pmp47 / dihydroxyacetone synthase

研究概要

ペルオキシソーム膜タンパク質(PMP)の機能およびペルオキシソームへのソーティング機構を解明することを目標として、酵母をモデル生物として生化学的、細胞生物学的な解析を行った。
Candida boidiniiのPmp47、Pmp20についてその発現制御をmRNAおよびタンパク質レベルで解析し、マトリクス酵素の解析結果と比較することにより検定した結果、マトリクス酵素の発現に先んじてPMPの発現が観察され、これらの発現制御がプロモーターレベルで行われていることを明らかにした。またPMP20、PMP30、PMP47遺伝子をクローニングし、これらの遺伝子破壊株を作成し、PMP30破壊株(pmp30Δ)、PMP47破壊株(pmp47Δ)について解析した。
pmp30Δ株はペルオキシソームマトリクス酵素にその代謝が依存するメタノール、オレイン酸、D-アラニンのうち、メタノールにのみ生育不能となった。さらに電子顕微鏡観察により、Pmp30がペルオキシソームの増殖や分裂・形態保持に関わっていることが明らかになった。またSaccharomyces cerevisiae PMP27遺伝子と真にホモログ遺伝子であることを両宿主を用いた相補実験により確認した。
pmp47Δ株もメタノールにのみ生育不能で、メタノールで誘導したpmp47Δ株ではジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)が細胞質で不活性型の凝集体を形成していたことから、Pmp47はDHASのペルオキシソームへの輸送あるいはフォールディングに関与していることが示唆された。さらに、ペルオキシソームを形成しない変異株でPMP47遺伝子を破壊した株について解析したところ、DHASは細胞質に活性型で存在していたことから、DHASのペルオキシソームへの輸送と活性発現にはPmp47が輸送する何らかの因子が必須の役割を演じていることがわかった。
つづいて、Pmp47のペルオキシソームへのソーティングシグナルについて解析した。Pmp47のアミノ酸配列の一部をレポータータンパク質と融合させ、その局在性を解析したところ、Pmp47アミノ酸配列でマトリクス側に面している225〜244番目までの20アミノ酸からなる親水性のループがペルオキシソーム膜内在性タンパク質のソーティングシグナル(mPTS)であることをはじめて明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Yasuyoshi SAKAI et al.: "The Candida boidinii peroxisomal membrane protein Pmp30 has a role in peroxisomal proliferation and is functionally homologous to Pmp27 from Saccharomyces cerevisiae" Journal of Bacteriology. 177・23. 6773-6781 (1995)
• [文献書誌] Yasuyoshi SAKAI et al.: "Isolation and characterization of mutants of the methylotrophic yeast,Candida boidinii S2 that are impaired in growth on peroxisome-inducing carbon sources" Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 59・5. 869-875 (1995)
• [文献書誌] Pamela A.Marshall et al.: "Pmp27 promotes peroxisomal proliferation" The Journal of Cell Biology. 129・2. 345-355 (1995)
• [文献書誌] Yasuyoshi SAKAI et al.: "The absence of Pmp47,a putative yeast peroxisomal transporter,causes a defect in transport and folding of specific matrix enzyme" The Journal of Cell Biology. 134・1. 37-51 (1996)
• [文献書誌] John M.Dyer et al.: "The sorting sequence of the peroxisomal integral membrane protein PMP47 is contained within a short hydrophilic loop" The Journal of Cell Biology. 133・2. 269-280 (1996)
• [文献書誌] Yasuyoshi SAKAI et al.: "Application of cellular functions of the methylotrophic yeast.Metabolism,gene expression and posttranslational process.Microbial Growth on Cl Compounds" M.E.Lindstorm and F.R.Tabita,Kluber Academic Publication, 9 (1996)