膜タンパク質のアンカリング補助因子と作用機構の探求

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07044197
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 伊藤 維昭 京都大学, ウイルス研究所, 教授 (90027334)
• 研究分担者: JOHNSON A.E テキサスA&M大学, 教授 ; 吉久 徹 京都大学, ウイルス研究所, 助手 (60212312) ; 秋山 芳展 京都大学, ウイルス研究所, 助手 (10192460)
• キーワード: 膜タンパク質 / FtsH / SecY / タンパク質膜透過 / 分泌 / 大腸菌 / 分子シャペロン

研究概要

1.分泌蛋白質前駆体のシグナル配列直後の領域にヘキサヒスチジン配列を挿入すると、その膜透過がNi^<2+>により、膜への結合直後でシグナル配列の切断前の状態で可逆的に阻害できることを見いだした。この方法が膜透過中間状態の捕捉に有用であることを示した。
2.ストップトランスファー配列による膜組み込みを、試験管内反応でアッセイするためのモデルとなる前駆体として、分泌蛋白質OmpAのC末端領域に内在性膜タンパク質由来の膜貫通配列を挿入したものを構築した。反転膜小胞を用いて、モデルタンパク質のストップトランスファー効率をアッセイする系を確立した。さらに、ストップトランスファー反応に、膜透過装置を構成するSecA, およびSecY‐SecE‐SecG複合体のみで充分であるのかを検討するため、Secタンパク質を精製し、人工プロテオリポソーム膜に再構成する系を確立した。
3.FtsH蛋白質は、以前の研究で提唱した膜蛋白質の組み込みに関与するほか、過剰発現したSecYタンパク質のようなある種の不安定な蛋白質の選択的な分解を司っていることを見いだした。FtsHを精製し、ATPase活性を測定し、ATP結合コンセンサス配列の重要性を明らかにした。FtsHはオリゴマー構造をしており、膜結合領域がFtsHサブユニット間の結合に重要であることを示した。一方、ftsH変異株におけるストップトランスファー欠損、分泌欠損の表現系が、それぞれ分子シャペロンHtpG(Hsp90相同体)、あるいはGroEによって特異的にサプレスされることを見いだした。また、ftsHの優性欠損変異のマルチコピーサプレッサーとして新たな遺伝子FdrAを同定した。

研究成果

• [文献書誌] Shimoike,T., Taura, T.,Kihara, A., Yoshihisa, T., Akiyama, Y., Cannon, K. and Ito, K.: "Product of a new gene, syd, functionally interacts with SecY when overproduced in Escherichia coli." J. Biol. Chem.270. 5519-5526 (1995)
• [文献書誌] Kihara, A., Akiyama, Y. and Ito. K.: "FtsH is required for proteolytic elimination of uncomplexed forms of SecY, an essential protein translocase subunit." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92. 4532-4536 (1995)
• [文献書誌] Akiyama, Y., Yoshihisa, T. and Ito, K.: "FtsH, a membrane-bound ATPase, forms a complex in the cytoplasmic membrane of Escherichia coli." J. Biol. Chem.270. 23485-23490 (1995)
• [文献書誌] Akiyama, Y. and Ito, K.: "A new Escherichia coli gene, fdrA, identified through suppression analysis of dominant negative ftsH mutations." Mol. Gen. Genet. 249. 202-208 (1995)
• [文献書誌] Shirai Y., Akiyama, Y. and Ito, K.: "Suppression of ftsH mutant phenotypes by overproduction of molecular chaperones." J. Bacteriol.178. 1141-1145 (1996)
• [文献書誌] Yoshihisa, T. and Ito, K.: "Pro-OmpA derivatives with His _6‐tag in its N‐terminal "traslocation initiation domain"is arrested by Ni^<2+> at an early post‐targeting stage of translocation across Escherichia coli inner membrane vesicles." J. Biol. Chem.271 (in press). (1996)