膜タンパク質のアンカリング補助因子と作用機構の探求

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07044197
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 伊藤 維昭 京都大学, ウイルス研究所, 教授 (90027334)
• 研究分担者: JOHNSON A.E. テキサスA&M大学, 教授 ; 秋山 芳展 京都大学, ウイルス研究所, 助手 (10192460)
• キーワード: 膜タンパク質 / FtsH / SecY / タンパク質膜透過 / 分泌 / 大腸菌 / 蛍光標識

研究概要

1.大腸菌において膜透過チャンネルの親水・疎水環境を蛍光標識によって測定するための系の構築を行った。分泌タンパク質OmpAのC末端側にジスルフィド結合を形成させることにより膜透過中間体を蓄積させることを確認した。これの無細胞タンパク合成において、蛍光標識の成功が実証されている酵母由来のLysyl-tRNA,Cysteinyl-tRNAが働き得る事を見いだした。
2.OmpAのC末端領域に内在性膜タンパク質LacY由来の膜貫通配列を挿入したものを用いて、ストップトランスファー配列による膜組み込みを、反転膜小胞への試験管内組込み反応によって解析した。さらに、ストップトランスファー反応が、膜透過装置を構成するSecA,およびSecY-SecE-SecG複合体のみで起こることを、Secタンパク質を精製し、人工プロテオリポソーム膜に再構成する系を用いて示した。
3.F tsHタンパク質は、以前の研究で提唱した膜蛋白質の組み込みに関与するほか、SecYタンパク質やF_1F_0 A TPaseのaサブユニットのようなある種の膜タンパク質サブユニットが複合体を形成し損なった時に分解するプロテアーゼでもあることを、精製タンパク質を用いて直接示した。また、FtsHは膜タンパク質HflKCと複合体を形成すること、HflKCはFtsH活性の調節因子として働くことをin vivo,in vitroの実験で明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Yoshihisa,T.and Ito,K.: "Pro-OmpA derivatives with His_6-tag in its N-terminal"translocation initiation domain"is arrested by Ni^<2+> at an early post-targeting stage of translocation across Escherichia coli inner membrane vesicles." J.Biol.Chem.271. 9429-9436 (1996)
• [文献書誌] Shirai Y.,Akiyama,Y.and Ito,K.: "Suppression of ftsH mutant phenotypes by overproduction of molecular chaperones." J.Bacteriol.178. 1141-1145 (1996)
• [文献書誌] Kihara,A.,Akiyama,Y.and Ito,K.: "A protease complex in the Escherichia coli plasma membrane:HflKC(HflA)forms a complex with FtsH(HflB),regulating its proteolytic activity against SecY" EMBO J.15. 6122-6131 (1996)
• [文献書誌] Akiyama,Y.,Kihara,A.,Tokuda,H.and Ito,K.: "FtsH(HflB)is an ATP-dependent protease selectively acting on SecY and some other membrane proteins." J.Biol.Chem.271. 31196-31201 (1996)
• [文献書誌] Akiyama,Y.,Kihara,A.and Ito,K.: "Subunit a of proton ATPase F_0 sector is a substrate of the FtsH protease in Escherichia coli" FEBS Lett.399. 26-28 (1996)