Naチャネル分子の神経細胞膜への集積過程の分子機構

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07044223
• 研究機関: 明治薬科大学
• 研究代表者: 高橋 國太郎 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (10010034)
• 研究分担者: MANDEL Gail ニューヨーク州立大学ストーニーブルック校 神経生物学, 行動科学部門, 教授 ; 平野 丈夫 京都大学, 医学部, 助教授 (50181178) ; 岡村 康司 通産省工業技術院, 生命工学工業技術研究所・生体分子工学部, 主任研究官 (80201987)
• キーワード: ホヤ胚 / Naチャネル発現制御 / TuNaI / TTX感受性変異体 / ギャップ結合強制発現 / 細胞間相互作用 / Two Hybrid法 / GFP融合遺伝子

研究概要

膜電位依存性Naチャネル分子がmRNAから蛋白に翻訳された後実際に細胞膜で機能するまでには、細胞体の固有の領域の細胞膜へ組み込まれる過程が必要である。本研究においては、内因性のNaチャネル分子の一次構造が明らかになっているホヤ胚単一神経細胞をアッセイ系として利用し、Naチャネル分子の膜集積過程の分子機構を解明することを目的とした。
平成7年度にホヤ神経系に発現する内因性のテトロドトキシン(TTX)抵抗性Naチャネル、およびこれと区別できる変異によりTTX感受性としたcDNA(ADTuNaI)を作成できた。本年度、(1)小野と岡村は哺乳類培養神経細胞においても、ホヤ胚と同様なTTX感受性の変異を用いたmarkerチャネルの手法を適用できるかどうかを検討するため、Mandel教授の研究室においてラット脳polyA+RNAからcDNAを合成しrepeatIIIのP-region特異的なPCRprimerを用いて増幅反応を行い電気泳動法により解析した。その結果、ラット脳cDNAからはホヤcDNAで見られるような増幅が全くなかった。従って、この部位の変異によるTTX抵抗性チャネルを哺乳類培養神経細胞に強制発現させることにより、これをmarkerチャネルとしてNaチャネル等の集積過程の解析が可能になると期待できる。
(2)ホヤ胚2細胞神経誘導系において蛋白燐酸化阻害剤を作用させ通常のNaチャネルの膜への集積開始時点を越えてギャップ結合が存続するとその期間だけNaチャネルの発現が遅延する。そこで、高橋等は(1)マウスコネキシンmRNAを注入して通常の集積開始時点を越えてギャップ結合を強制発現したところ、その期間だけNaチャネルの発現が遅延した。(2)平成7年度にMandel研究室で習得した技術により、connexin遺伝子にGFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子を結合して融合蛋白を作成してホヤ胚に発現させることを計画し、まずGFPmRNAを分裂抑制ホヤ胚割球にいれて発現させた。

研究成果

• [文献書誌] Saitoe,M.,Inazawa,T. & TAKAHASHI,K.: "Neuronal expression in cleavage-arrested ascidian blastomeres requires gap junctional uncoupling from neighbouring cells." Journal of Physiology(Lond.). 491. 825-842 (1996)
• [文献書誌] 高橋國太郎,斉藤 実,岡村康司: "膜興奮性から見たホヤ幼生の神経細胞分化-2割球系での細胞間相互作用とチャネル分子の動態-" 生物物理. 205. 134-138 (1996)
• [文献書誌] Okamura,Y.,Nagahora,H.& Okada,T.: "TuNa II : a putative sodium channel gene specifically expressed in ascidian motoneuron lineage." Neuroscience Research. suppl 20. S27- (1996)
• [文献書誌] Okada,T.& Okamura.Y,: "Identification of neuronal cells by detecting ion channel mRNA in the larva of the ascidian,Halocynthia roretzi." Zoological Science. 13 suppl. 95- (1996)
• [文献書誌] Funabiki K.,Mishina M.& Hirano T.: "Retarded vestibular compensation in mutant mice deficient in delta 2 glutamate receptor subunit." Neuroreport 7(1):189-92. 7(1). 189-192 (1995)
• [文献書誌] Dawes H.,Mandel G.& Matthews G.: "Identification of sodium channel subtypes induced in cultured retinal pigment epithelium cells." Vis.Neuroscience. 12(5). 1001-1005 (1995)
• [文献書誌] 高橋國太郎: "興奮性膜 標準生理学4版(本郷,豊田,熊田 編),第2章I." 医学書院, 1017 (1996)
• [文献書誌] 高橋國太郎,小澤〓司,宮崎俊一: "神経・シナプス アトラスで学ぶ生理学(高田編)第3章" 丸善株式会社, 281 (1996)
• [文献書誌] Okamura,Y.,Ono,F.& Okagaki,R.: "Regulation of sodium channel gene expression by celI-specific interactions in the ascidian embryo.In Basic Neuroscience in lnvertebrates,ed by Koike,H.et al." Japan Scientific Societies Press, 367 (1996)