| 研究課題/領域番号 |
07044223
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| 研究種目 |
国際学術研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 共同研究 |
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| 研究機関 | 明治薬科大学 |
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研究代表者 |
高橋 國太郎 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (10010034)
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| 研究分担者 |
MANDEL Gail ニューヨーク州立大学, ストーニーブルック校・神経生物学・行動科学部門, 教授
平野 丈夫 京都大学, 医学部, 助教授 (50181178)
岡村 康司 通産省, 工業技術院・生命工学工業技術研究所・生体分子工学部, 主任研究官 (80201987)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1996
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| キーワード | ホヤ胚 / Naチャネル発現制御 / TuNaI / TTX感受性変異体 / ギャップ結合強制発現 / 細胞間相互作用 / Two Hybrid法 / GFP融合遺伝子 |
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| 研究概要 |
目的 膜電位依存性Naチャネルは神経細胞の活動電位を形成する重要な機能素子である。Naチャネル分子がmRNAから蛋白に翻訳された後実際に細胞膜で機能するまでには、チャネル分子の細胞内領域と細胞内骨格系の相互認識を介して分子間での会合が起こり、軸索、細胞体、軸索終末部など固有の領域の細胞膜へ組み込まれる過程が必要である。本研究においては、Naチャネル分子の一次構造とそれに対応するチャネルの性質が明らかになっているホヤ胚単一神経細胞をアッセイ系として利用し、これに酵母のtwo-hybridシステム及びgreen fluorescent protein(GFP)を用いた光学的観測システムを適用して、Naチャネル分子の膜集積過程の分子機構を解明することを目的とした。
計画 平成7年度にホヤ神経系に発現する内因性のテトロドトキシン(TTX)抵抗性Naチャネル、およびこれと区別できるチャネル内のアミノ酸を変異させTTX感受性としたcDNA(ADTuNaI)を作成できた。平成8年度ではこれを用いて以下の実験を行う事を計画した。(1)外因性に注入したmRNAからのNaチャネルの膜への発現時間、発現量が内因性の場合とどう異なるか調べる。(2)内因性のmRNA転写時期と異なった時期に外因性に注入し、α-サブユニット以外に発現を制御する因子(例えばβ-サブユニット)との関連を解析する。(3)ADTuNaIチャネル分子の欠失変異を作製してそのmRNA注入し、集積過程に関わる領域を同定する。(4)平成7年度の研究によりホヤ2細胞誘導系でギャップ結合の消失を遅延させるとその機関だけNaチャネルの発現が遅延することがわかった。そこでconnexin-GFP蛋白を発現させてギャップ結合を通過する集積制御因子を探索する。
成果 計画(1)(2)について:(1)岡村と小野はホヤ神経系に発現する内因性のNaチャネル電流と区別するため、TuNaI Naチャネル内のテトロドトキシン結合部位のアミノ酸を変異させたcDNA(ADTuNaI)を作成し次の実験を行った。ADTuNaIのRNAを注入し、総Naチャネルの発現量の変化を定量し、無注入の場合と比較したところ、TTX感受性Naチャネルが発現しても、内因性と外因性の総発現量は不変であった。しかし、注入した細胞では、コントロール群に比べ、Kチャネル電流量が有意に大き
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かった。
(2)さらに、小野と岡村は哺乳類培養神経細胞においても、ホヤ胚と同様なTTX感受性の変異を用いたmarkerチャネルの手法を適用できるかどうかを検討するため、哺乳類神経細胞でのNaチャネルの発現実験で著名なMandel教授の研究室においてラット脳のTTX抵抗性Naチャネルの分子種に関して解析した。とくにラット脳polyA+RNAからcDNAを合成し、repeat IIIのP-regon特異的なPCRprimerを用いて増幅反応を行い電気泳動法により解析した。その結果、ラット脳cDNAからはホヤcDNAで見られるような増幅が全くなかった。従って、ラット脳では無脊椎動物で見られる様なrepeatIIIでの変異によるTTX抵抗性チャネルが存在する可能性は少ない。従って、この部位の変異よるTTX抵抗性チャネルを哺乳類培養神経細胞に強制発現させることによりmarkerチャネルとして集積過程の解析が可能になると期待できる。計画(3)について:すでに平成7年度中にNaチャネル細胞内領域をGAL4転写活性化部位ベクター(pGBT9)に組み込み、yeast strainであるHF7Cに導入し、Two Hybrid法をもちいてコンセンサス領域結合蛋白をスクリーニングするためのライブラリーをEggen博士の参加を得て岡村等が作成した。計画(4)について:ホヤ胚8細胞胚より単離した外胚葉割球を予定脊索割球と接着して培養すると細胞間相互作用により神経細胞に分化する。このとき蛋白燐酸化阻害剤を作用させる通常のNaチャネルの膜への集積開始時点を越えてギャップ結合が存続し、かつその期間だけNaチャネルの発現が遅延することがこれまでの研究によりわかっている。本年度の高橋等の研究成果として(1)マウスコネキシンmRNAを注入して通常の集積開始時点を越えてギャップ結合を強制発現したところ、その期間だけNaチャネルの発現が遅延した。(2)注入したmRNAによって実際に外来性のconnexin分子が合成されて細胞間結合部に分布していること明らかにするため、平成7年度にMandel研究室で習得した技術により、connexin遺伝子にGFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子を結合して融合蛋白を作成してホヤ胚に発現させることを計画し、まずGFPmRNAを分裂抑制ホヤ胚割球にいれて発現させることに成功した。現在、GFPギャップ結合融合蛋白クローンのmRNAの強制発現を試みている。 隠す
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