| 研究課題/領域番号 |
07044236
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
桑野 良三 新潟大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (20111734)
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| 研究分担者 |
NISHIYAMA Ak Cleveland clinic Foundation, Research A
花岡 和則 北里大学, 理学部, 教授 (40189577)
熊西 敏郎 新潟大学, 脳研究所, 教授 (40018601)
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| キーワード | アストロサイト / トランスジェニックマウス / 神経機能 / 遺伝子発現 / S100蛋白 / GFAP / ジフテリアトキシン / Cre-lox |
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| 研究概要 |
7年度に予定した研究計画は1)導入遺伝子の作製と2)その融合遺伝子をin vitroに用いた発現効果の検討である。
1)の導入遺伝子の作製についてはアストロサイト特異的遺伝子(S100)プロモーターに細胞破壊用のジフテリアトキシンAフラグメント遺伝子(DT-A)に結合した。本実験の目的であるアストロサイトを選択的に破壊するために、細胞特異的遺伝子発現の精度をあげる必要が生じた。この問題を解決するために部位特異的リコンビエーションをおこすCre-lox系を導入することにした。CreマウスにはS100プロモーターをloxマウスにはGFAPのプロモーターを使って、両方の遺伝子が発現する場であるアストロサイトで選択的細胞破壊を引き起こすための導入遺伝子を構築した。
2)については新生児脳から初代培養系を確立できた。培養細胞に導入遺伝子をリン酸カルシウム法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法で導入し、tacZの発現をX-galで染色したところ、導入効率が低く評価が困難であった。細胞破壊用の融合遺伝子と蛍光色素をまぜてマイクロインジェクション法で直接アストロサイトーマ由来のC6細胞とニューロブラストーマ由来のB103細胞に注入して細胞特異的遺伝子発現の制御を観察している。S100プロモーターに駆動されるCreがC6細胞で発現していることを確認した。細胞への導入効率を高めるために単層培養では、ほぼ100%の効率で遺伝子導入できるアデノベクターの使用が良いことが分かった。
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