| 研究課題/領域番号 |
07044282
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
山村 研一 熊本大学, 医学部, 教授 (90115197)
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| 研究分担者 |
BALLING Rudo ドイツ哺乳類遺伝学研究所, 所長
今井 賢治 ドイツ哺乳類遺伝学研究所, 研究員
ARTZT Karen テキサス大学, 動物学, 教授
要 匡 熊本大学, 医学部, 助手 (40264288)
阿部 訓也 熊本大学, 医学部, 助教授 (40240915)
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| キーワード | トランスジェニックマウス / YAC / BAC / 発生 / ポジショナルクローニング / 突然変異体 |
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| 研究概要 |
本研究ではポジショナルクローニング法とトランスジェニックマウス技術を結びつけ、巨大ゲノムDNA導入による突然変異の機能的レスキューを指標とし、突然変異責任遺伝子を同定、単離する手法を確立することを目的とする。前年度はYAC(酵母人工染色体)導入マウス作製の基本技術の確立を行ない、3系統のトランスジェニックマウスの樹立に成功した.YACクローンはインサートサイズが他のクローニングシステムと比較して大きいという利点を持つが、酵母内での相同組換えによりキメラ形成や欠失などDNAの再構成がかなりの頻度で起こることが知られている.実際、我々の用いたYAC650kbの内左右両端、計350kb程度はキメラ部分であった.このようなYACの性質から、正確なゲノムの物理地図を作るのは困難な場合があり、さらにYACレスキューを指標として原因遺伝子を同定しようとする場合、ポジティブな結果が得られればよいが、ネガティブな場合は結論がでないことになる.BAC(細菌人工染色体)は大腸菌内で複製し、150-300kb程度のインサートを持つ.したがってインサートサイズはYACより小さいがより安定に存在し、DNA再構成は殆どないことが知られている.我々はtw5、tkの領域においてこれまでYACによってカバーしていた部分をBACで取り直しコンティグを作製した.その結果、tk遺伝子座ではD9Mit9を中心とした約500kb、4種類のBACクローンでカバーされる領域に原因遺伝子が存在することを見出し、t^<w5>ではH-2KからD17Mit148までの約1000kbのゲノム領域に原因遺伝子があり、その大半の部分をBACによってクローニングした.さらに、tk領域のBACクローンを導入したトランスジェニックマウス作製を始めている.BACインサートの調製はYACDNA調製に用いた方法を応用し、ラムダファージのタ-ミネース酵素で線状化し、マイクロインジェクション法にてマウス受精卵に導入した.その結果、これまで24匹のマウスが得られ、4匹にトランスジーンの組込みが認められた(うち2匹は出生時に死亡).現在これから系統の樹立を行っており、また他のクローンに関してもDNA調製、トランスジェニックマウス作製を進めている.
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