| 研究概要 |
極限微生物由来の酵素がどのようにして極限環境に適応しているかについては,ほとんど明らかにされていない.本研究では、アルカリ性条件下で高活性を示す好きアルカリ性バシラス属細菌41M-1株に由来するアルカリキシラナーゼを例にとり,その好アルカリ性機構の分子レベルでの解明を目的として,遺伝子のクローニングとタンパク質工学検討を行った.
1.PCRによるアルカリキシラナーゼ遺伝子の増幅
既に明らかにしている41M-1株由来アルカリキシラナーゼの部分アミノ酸配列に基づいて,PCR用プライマーDNAを化学合成した.そして41M-1株染色体DNAを鋳型とするPCRを行い,本菌アルカリキシラナーゼ遺伝子の一部の増幅に成功した.
2.41M-1株部分染色体ライブラリーの作成
41M-1株染色体DNAを種々の制限酵素で切断した後,先に得られたPCR産物をプローブとするDNA断片を調製ゲル電気泳動法にて精製した後,プラスミドベクターに連結,そして大腸菌に形質転換し,部分染色体ライブラリーを作成した.
3.アルカリキシラナーゼ遺伝子の染色体からのクローニング
キシランを含む平板培地上でのキシラナーゼ活性を指標とする方法により,本菌アルカリキシラナーゼ遺伝子を含むクローンを選抜した.得られたアルカリキシラナーゼ遺伝子についてDNA塩基配列の決定を行い,本酵素の一次構造を明らかにした.
4.アルカリキシラナーゼのタンパク質工学検討
本酵素にアミノ酸置換を導入した変異型酵素を精製し,野性型酵素との活性比較を行った.その結果,本酵素の触媒活性発現に重要な役割を担うアミノ酸残基を特性することができた.
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