メカニズムの理解にもとづく標的遺伝子組換えの改良

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07260205
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 小林 一三 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (30126057)
• キーワード: 遺伝子ターゲッティング / 遺伝子治療 / 相同組換 / アデノウィルス / ランダムウォーク / 非相同組換え / パピローマ / recA

研究概要

A.「相同相互作用による非相同組換え」の解析。A-1.マウスでの検出と構造解析。BPVベクターのコトランスフェクションで相同組換えを選択したときに検出される非相同組換え産物の構造解析を進め、BPV複製との関係を示唆する結果を得た。A-2.定量系の確立。「相同相互作用による非相同組換え」産物を特異的に定量できる実験系を作った。これは、大腸菌の優性の薬剤(ストレプトマイシン)感受性遺伝子を逆向きに二つ持つプラスミドを、マウス細胞に導入し、二つの遺伝子が共に失われたものを、大腸菌に導入して薬剤で選択するというものである。A-3.大腸菌での検出。大腸菌の核酸分解酵素欠損株で、ホモロジーの端での非相同組換えを検出した。これは、recA機能に依存していた。B.アデノウイルスペクターで導入した遺伝子による標的遺伝子組換えに伴う非相同組換え。ウシパピローマウイルスプラスミドを染色体外にもつ細胞にドナーの組換えアデノウイルスを感染させ、その間での相同組換えで再構成されたneo+遺伝子を含む細胞のクローンを選択する系で、アデノウイルス部分が組み込まれた産物の解析をシークエンスレベルで行い、非相同組換えを検出した。C.相同組換え効率のホモロジーの長さと程度への依存性の理論の一般化。「中間体の連結部分がホモロジーにそってDNAの塩基対をランダムウォークし、ときに相同組換え体などへとプロセスされる。ホモロジーの端へぶつかれば、ある確率で、中間体が破壊される。」という一般的な場合について、相同組換え体の完成頻度がホモロジーの長さにどう依存するかについて、検討した。得られる結果を、従来の遺伝子ターゲッティングなどのの実験結果と比較した。

研究成果

• [文献書誌] Yamamoto,K.,Fujtani,Y.,and Kobayashi,I.: "Orientation-dependence in Homologous Recombination." Genetics. (in press). (1996)
• [文献書誌] Fujitani,Y.and Kobayashi,I.: "Random walk model of homologous recombination" Physical Rev.E.52. 6607-6622 (1995)
• [文献書誌] Kusano,K.,Naito,T.,Handa,N.and Kobayashi,I.: "Restriction-modification systems as genomic parasites in competition for specific sequences" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92. 11095-11099 (1995)
• [文献書誌] Fujita,A.,Sakagami,K.,Kanegae,Y.,Saito,Izumu and Kobayashi,I.: "Gene Targeting with a Replication-Defective Adenovirus Vector" J.Virol.69. 6180-6190 (1995)
• [文献書誌] Fujitani,Y.,Yamamoto,K.,and Kobayashi,I.: "Dependence of Frequency of Homologous Recombination on the Homology Length" Genetics. 140. 797-809 (1995)
• [文献書誌] Naito,T.,Kusano,K.,and Koboyashi,I.: "Selfish behavior of restriction-modificatic systems" Science. 267. 897-899 (1995)
• [文献書誌] Yokochi,T.,Kusano,K.and Kobayashi,I.: "Evidence for conservative(two-progeny)DNA double-strand break repair" Genetics. 139. 5-17 (1995)
• [文献書誌] 中山洋一,小林一三: "制限酵素はなぜあるのか?塩基配列に棲み分けた寄生遺伝子群" 化学と生物. 34. 73-75 (1996)
• [文献書誌] 小林一三: "遺伝子ターゲッティングのメカニズムとその効率化…“遺伝子の治療"をめざして" 蛋白質核酸酵素. 40(17). 2645-2653 (1995)
• [文献書誌] 小林一三: "“利己的な遺伝子"単位としての制限酵素メチル化酵素系" 細胞工学. 14(9). 1015-1023 (1995)
• [文献書誌] 内藤拓、小林一三: "プログラム細胞死と「利己的な遺伝子」…制限酵素はなぜあるのか?" 実験医学. 13(8). 1444-1447 (1995)
• [文献書誌] 小林一三: "「遺伝子ターゲッテイングによる「遺伝子の治療」の実現へ向けて」" 最新医学. 50:17. 1718-1730 (1995)
• [文献書誌] Kobayashi,I.,Sakagami,K.,Kusano,K.,Fujitani,Y.and Takahashi-Kobayashi,N.: "Homologous interaction as a destruction process:Hypotheses for homology-driven non-homologous recombination and double-strand break repair.Modification of gene expression and non-Mendelian inheritance" Proceedings of the US-Japanese joint meeting.Oono,K.Takaiwa,F.(eds.)National Institute of Agrobiological Resources,Ministry of Agriculture,Forestry and Fisheries,Tsukuba Science City,Ibaraki,Japan. 55-76 (1995)
• [文献書誌] 小林一三: "期待される新たな展開" 「第10回「大学と科学」公開シンポジウム:遺伝子治療…新しい治療への期待」クバプロ. 刊行中.
• [文献書誌] Kobayashi,I.: "Adenovirus-mediated gene transfer,homology-associated non-homologous recombination and hojology-length dependence.Proceedings of 9th symposium “Molecular Biology of Hematopoisesis"" Homologous gene targeting for human gene therapy, (in press)
• [文献書誌] 小林一三: "「遺伝子の組換え」in 医科分子生物学 第3版(村松編)" 南江堂, (刊行中