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1.HD責任遺伝子(IT15)の転写開始点の決定 本項目はLinらの報告により2ヵ所の転写開始点が決定された。2.80リピートのCAGを持つDNAの構築(マウスゲノムDNAクローンの精製)マウスES細胞細胞由来の129SV genomic DNA ライブラリーからマウスhuntingtin のエクソン1周辺のphage クローン(3種類)を得た。制限酵素地図の解析結果から、エクソン1を挟んで上流と下流共に約8Kbの領域を有していた。(80リピートのCAGを挿入したDNAの構築)東京大学・医学部、金沢一郎教授より分与されたハンチントン病患者由来リンパ球細胞よりgenimicDNA を精製してDNAライブラリーを作成した。その結果、82、42、29リピートをエクソン1に持つEcoRI フラグメント(4.1Kb)を得た。(80リピートのCAGを持つ患者ゲノムDNAを用いたDNAの構築)huntingtin 遺伝子のエクソン1上流6Kbと下流2.5Kbを用いてES細胞挿入用DNAを構築する。マウスエクソン1はヒト患者エクソン1と入れ替え、両端に陰性選択遺伝子を結合させた。さらに、陽性選択遺伝子(neo遺伝子)はhuntingtin 遺伝子と逆向きにエクソン1の500bp下流に挿入した。この遺伝子の両端にはloxP配列があり、Cre蛋白質により最終的にneo遺伝子を取り除くができるようにした。3.HDモデルマウスの作成 現在、上記のDNAを選択マーカー遺伝子と結合し、DNAの構築を終了した後、マウスES細胞内へエレクトロポーレーションにて挿入する。目的のDNA挿入細胞を選択後、母方のマウスへ移植して第一世代を得た後、掛け合わせにより、第二世代を獲得して実験に供する。
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