特殊抗体と合成ペプチドを用いたプロテインキナーゼCの細胞内動態の解析

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07273215
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 大海 忍 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (20160046)
• 研究分担者: 村松 正明 東京大学, 医科学研究所, 助手 (50230008)
• キーワード: プロテインキナーゼ / タンパク質リン酸化 / タンパク質分解 / プロテアーゼ / 抗体 / 合成ペプチド / アポトーシス / 細胞死

研究概要

プロテインキナーゼC(PKC)のダウンレギュレーションの引き金と考えられている、カルパインによるPKCの限定分解を特異的に検出するための特殊抗体(切断部位特異抗体)を開発した。PKCにカルパインをin vitroで作用させて調製した断片の末端アミノ酸配列に基づいて、ハプテンとして使用するペプチドを合成した。これをウサギに免疫して得た抗体は、45-kDaのPKC断片に特異的に結合し、カルパインによる切断を受けていない80-kDaポリペプチドとは反応しなかった。カルシウムイオノフォア処理をして細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させた血球系培養細胞において、同様にして作成した活性型カルパインに対する切断部位特異抗体によってカルパイン前駆体の活性化とともにPKCの限定分解を検出した。これらの抗体を、血清除去によって細胞死(アポトーシス)を誘導したヒト繊維芽細胞TIG-3に適用すると、活性型カルパインおよびPKCαの断片がアポトーシス細胞に観察された。カルパイン阻害剤によってアポトーシスの亢進がおこることと併せて考えると、カルパインは細胞死を負の方向に制御し、PKCαがカルパインによるタンパク質分解の標的分子のひとつとしてアポトーシス抑制に関与している可能性が示唆される。

研究成果

• [文献書誌] Kikuchi,H.: "Activation and possible involvement of calpain,a calciun-activated cysteine protease,in down-regulation of apoptosis of human monoblast U937 cells." Cell Death & Differentiation. 2. 195-199 (1995)
• [文献書誌] Kikuchi,H.: "Antibodies specific for proteolyzed forms of protein kinase Cα." Biochim.Biophys.Acta. 1269. 253-259 (1995)
• [文献書誌] Ogawara,M.: "Differential targeting of protein kinase C and CaM kinase II signalings to vimentin." J.Cell.Biol.131. 1055-1066 (1995)
• [文献書誌] Imajoh・Ohmi,S.: "Lactacystin,a specific inhibitor of the proteasome,induces apoptosis in human monoblast U937 cells." Biochem.Biophys.Res.Commun.217. 1070-1077 (1995)
• [文献書誌] Murakami,A.: "Absence of down-regulation and translocation of the η isoform of protein kinase C in normal human keratinocytes." J.Invest.Dermatol.(印刷中). (1996)
• [文献書誌] Takai,Y.: "Mitosis-specific phosphorylation of vimentin by protein kinase C coupled with the organization of intracellular membranes." J.Biol.Chem.(印刷中). (1996)