| 研究概要 |
1.紫外線誘発腫瘍よりcDNAライブラリーの作成
UV♂-ldよりグアニジウム法、Oligo(dT)-LatexによってmRNAを抽出精製した。cDNAは合成キットを用い一方向性に発現ベクターpcDNA3のクローニングサイトに組み込んだ。
2.腫瘍拒絶抗原認識CTLを用いた抗原のcDNAスクリーニング
UV♂-ldをCTLと混合培養し培養上清中に遊離されたサイトカインをELISA、バイオアッセイ等を用い解析した。スクリーニングの指標となるサイトカインとしてはGMCSF、TNF-α,IFN-γなどが考えられたが、UV♂-ldの腫瘍拒絶抗原認識CTLの中で最も感度が高かった10T7ではGMCSF、IFN-γの産生が高くTNF-αの産生は低かった。精度に関してはトランスフェクション標的細胞数種類を検討しCOS細胞Kdを有するマウス線維芽細胞を用いてUV♂-ld細胞と混合培養しバックグラウンドシグナルの程度を検討した。pcDNA3-β-Galによる発現効率の解析結果は表1の如くで発現効率は本システムに関する限りCOS7細胞が最良の結果を示した。同時に検討したCMS8、BALB/3T3などのマウス線維芽細胞ではトランスフェクション効率は非常に低かった。バックグラウンドの高低に関してはトランスフェクション標的細胞よりはCTLの状態が大きく影響することが明らかとなった。即ちCTLをIL2とIL7で維持した場合には腫瘍拒絶抗原を有するUV♂-ld細胞が0%でも強いシグナルを認めるのに対し、同系マウス脾細胞をフィーダーとして加えた場合はを0.78%まで検出できるがそれ以下では非特異的シグナルは消失し特異性の高いアッセイとなることが判明した。現在これらの課題を改善し効率よく抗原のcDNAスクリーニングを進めている。
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