| 研究課題/領域番号 |
07407074
|
|---|
| 研究種目 |
一般研究(A)
|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
多田 道彦 大阪大学, 医学部, 教授 (90093434)
|
|---|
| 研究分担者 |
西田 昌司 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員
大津 欣也 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員
葛谷 恒彦 大阪大学, 医学部, 助教授 (80150340)
|
|---|
| キーワード | 心筋小胞体 / 発現調節機構 / 心筋小胞体カルシウム遊離チャネル / 興奮収縮関連 |
|---|
| 研究概要 |
心筋小胞体カルシウム(Ca)遊離チャネル(RYR2)は興奮収縮関連に重要な役割を果たしている。心筋では活動電位により筋形質膜のCaチャネルが開き、細胞外から流入した少量のCaが刺激となり、RYR2から大量のCaが遊離する。RYR2遺伝子は組織特異的発現あるいは病態に応じた発現の変化を示すが、その発現調節機構は解明されていない。そこで、本年度ではRYR2遺伝子の5'上流調節領域の単離および発現調節機構の解明を試みた。ゲノミックライブラリーより5'上流調節領域を含むと考えられる3.8kbのDNA断片を得た。RYR2遺伝子の5'上流調節領域にはTATAボックスやCAATボックスはなかった。GCボックス、Sp1結合部位、Enhancer coreコンセンサス配列、AP1結合部位、AP2結合部位、MEF2結合部位、E boxが存在した。primer extension法により転写開始点を決定を行ったところ翻訳開始点より335bp上流に存在した。一連のdeletion mutantを作製し、初代培養心筋細胞中における転写活性を検討した。転写活性は5'端を-90まで欠失させたコンストラクトが最高の転写活性を示した。-74ないし-69まで欠失させたコンストラクトの転写活性は低下した。さらに-90から-70領域の二重鎖オリゴヌクレオチドは核蛋白質と結合した。次に、5'上流調節領域の調節領域を決定するために、-95から-66領域に変異を導入した。-89から-84領域(RYRP1)は第一の転写調節領域と考えられた。-74から-66領域(RYRP2)は第二の転写調節領域と考えられた。これらの転写調節領域は、報告されている転写因子の結合配列とホモロジーを示さなかった。転写活性の心筋特異性を検討するために、同様のdeletion mutantsをC2C12に導入した。この正の調節領域は心筋特異的でないとわかった。209から-90領域には骨格筋においてRYR2遺伝子を発現させない負の調節領域の存在が示唆された。
|
