| 研究課題/領域番号 |
07456049
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
山田 康之 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (50026415)
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| 研究分担者 |
西岡 孝明 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80026559)
橋本 隆 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (80180826)
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| キーワード | 立体特異性 / 還元酵素 / 結晶構造解析 / アルカロイド |
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| 研究概要 |
大腸菌による大量発現系・精製系の確立
大量の精製酵素を供給するため、Datura stramonium由来の両TRcDNAをpET21dベクターにクローニングし、可溶性タンパクを効率よく得るための培養・誘導条件を検討した。その結果、TR-IではLB倍地中0.1mMのIPTGで37℃、250rpm、3時間の誘導で、またTR-IIでは25℃、100rpm、16時間の誘導で、最大量の可溶性発現タンパク質が得られ、以降これらの条件で培養を行った。次にこれら発現TRタンパク質の精製条件を検討した。TR-Iでは2種のHIC及び、色素リガンドアフィニティー、イオン交換のカラムクロマトグラフィーで、一方TR-IIでは2種のHIC及びイオン交換のカラムクロマトグラフィーで精製した。両者とも5Lの培養液から約20mgの高純度なタンパク質が得られた。
TR結晶化条件のスクリーニングと最適化
市販の結晶化条件スクリーニングキット(Crystal Screen,Hampton Research)をもちいて、Hanging drop蒸気拡散法により結晶化条件の1次スクリーニングをおこない、両酵素で複数の候補を得た。これらの結晶化条件を最適化し、X線を照射出来る大きさの結晶が得られる条件を数種得た。
結晶学的諸性質の決定
得られた結晶のプレセッション写真を撮影し、結晶系、空間群、格子定数など結晶の性質を調べた。その結果、TR-IではX線構造解析に適した性質をもつ結晶が1つ得られた。TR-IIの結晶はモザイシティーの高さに起因する回折斑点の不分離が見られた。そこで再度結晶化条件のスクリーニングをおこない、明確な回折斑点を与える結晶を得ることが出来た。
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