| 研究概要 |
本研究の目的はCREB,CRPなどの転写調節蛋白などのDNA結合蛋白がどのようにDNAを認識し、結合するかをイメージングにより明らかにすることである。これまで遺伝子と転写調節因子との結合はゲルシフトなどで予測していたため、結合過程でいかなる形態変化が起こるかは不明であった。そこで、転写調節因子CREBについてはソマトスタチンの遺伝子5′側のプロモーター領域を含む約1000または800塩基を切り出し、結合させたあと、噴霧法によりマイカ劈解面上に展開し、低温低角度回転蒸着法により観察した。この方法により現在はDNAラセン構造の1/2ピッチ(5塩基対)を一つの単位として再現良く観察できるばかりでなく、最適な蒸着量の時は塩基対も観察できるようになった。すでにCREBとソマトスタチン遺伝子プロモーターとの結合様式がわかり論文にまとめている。そこで本年度は大腸菌RNAポリメラーゼの構造とミュータントDNA(UV5)との結合にはじまる転写過程の構造解析を試みた。そして、大腸菌のRNAポリメラーゼは四つの大きなドメインからなることを明らかにした。既に生化学的にRNAポリメラーゼはβ,β′αα,σの各サブユニットからなることおよびそれらの分子量が明らかであるので、それらを指針にして低温低角度回転蒸着法で得られたドメイン構造を同定した。RNAポリメラーゼには二つのチャンネルがあるが、ひとつはββ′と2αの間にある大きなチャンネルであり、もうひとつはβとβ′との間にスリット状に存在するものである。DNAと結合させたのち、低角度回転蒸着法で観察するとα,β間の大きなチャンネルにDNAが入り込むので、もう一つのチャンネルはmRNAの出てくるところと結論ずけられる。
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