光ピンセットと近接場光によるチャネル及びトランスポータ分子の機能・構造連関の研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07457010
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 片山 芳文 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (20014144)
• 研究分担者: 古川 哲史 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (80251552) ; 辰巳 仁史 名古屋大学, 医学部, 助手 (20171720)
• キーワード: 光ピンセット / 近接場光 / イオンチャネル / トランスポータ / 膜蛋白分子 / 微分干渉顕微鏡 / 近接場顕微鏡 / クローニング

研究概要

本研究は光ピンセットと光近接場効果を利用して、生きた細胞で膜イオンチャネルやトランスポータなどの膜蛋白分子を捕捉・操作し、その時のチャネル及びポンプ膜電流を解析し、これらの膜蛋白分子の機能と構造の関連を究明することを目的とする。
1.昨年度はビデオ強化型微分干渉顕微鏡に組み込まれている光ピンセットの捕捉力を強化するために100mWのアルゴン・クリプトンレーザを導入した。培養神経細胞で、この光ピンセットを用いて成長円錐の表面に付着させたラテックスビーズを捕捉して、移動(0.1から1μm)させることができた。このとき、1pNの力が必要であった。
2.走査型近接場顕微鏡を用いて、培養神経細胞の神経突起の平坦部に幅25nm以下のマイクロチューブ様の構造を観察することができ、同時に、チュブリンを重合させて形成したマイクロチューブを同顕微鏡で観察したものと比較して確認した。
3.家兎心筋からクローニングしたクロライドチャネルのCICファミリー(rabCIC-2αとrabCIC2-β)のcRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、膜電位固定法で発現電流を記録した。その結果、rabCIC-2αは伸展刺激による活性化されるクロライド電流を発現すること、rabCIC-2βでは伸展刺激無しでも活性化し、伸展刺激応答領域はrabCIC-2αのN端にあることが分かった。
4.全反射型近接場光学顕微鏡を試作した。ダイ・アイで染めた細胞膜をカバーグラス上に置くと、膜を染めたダイ・アイが光近接場に入った時に励起されるので検出できる。こうして、細胞膜表面の形状を観察できる。

研究成果

• [文献書誌] Hirai,K.,Katayama,Y.and Misu,Y.: "L-DOPA induces concentration-dependent facilitation and inhibition of presynaptic acetylcholine release in the guinea-pig submucous plexus." Brain Res.718. 105-111 (1996)
• [文献書誌] Morita,K.and Katayama,Y.: "Tetraethylammonium-sensitive calcium-sensitive pottasium current in a subclass of the bullfrog dorsal root ganglion cells." Neuroscience Letters. 215. 193-196 (1996)
• [文献書誌] Furukawa,T.,Yamane,T.,Terai,T.,Katayama,Y.and Hiraoka,M.: "Functional linkage of the cardiac ATP-sensitive K+ channel to the actin cytoskeleton." Pflugers Arch.431. 504-512 (1996)
• [文献書誌] 辰巳仁史,片山芳文: "光ピンセットを用いて細胞膜蛋白分子間の相互作用を計測する技術." 中谷電子計測技術振興財団年報. 10. 66-71 (1996)
• [文献書誌] Soeda,H.,Tatsumi,H.and Katayama,Y.: "Neurotransmitter release from growth cones of rat dorsal root ganglion neurons in culture." Neuroscience. (in press). (1997)
• [文献書誌] Tatumi,H.and Katayama,Y.: "Observation of growth cones of rat cultured neurons with evanescent light microscope." Neuroscience Research Suppl.20. S129 (1997)