光ピンセットと近接場光によるチャネル及びトランスポータ分子の機能・構造連関の研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07457010
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 片山 芳文 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (20014144)
• 研究分担者: 辰巳 仁史 名古屋大学, 医学部, 助手 (20171720) ; 古川 哲史 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (80251552)
• キーワード: 光ピンセット / 近接場光 / イメージング / カルシウムチャネル / クロライドチャネル / メカノレセプター / 近接場光学顕微鏡 / 神経成長円錐

研究概要

培養したラットDRG細胞の成長円錐からのグルタメート放出はカルシウム依存性である。本年度は、ω-agatoxinによって選択的に抑制されるカルシウムチャネルを金コロイドや蛍光色素を利用して免疫学的に標識・可視化し、電子顕微鏡あるいは近接場顕微鏡で観察することを企画し、まず電子顕微鏡で成功した。すなわち金コロイドは神経成長円錐や細胞体の表面に存在することを観察し、グルタメート放出に関与するω-agatoxin感受性のカルシウムチャネルが成長円錐に存在することを免疫学的に確認した。
伸展刺激に応答するイオンチャネルの伸展刺激応答機構を近接場光学顕微鏡を用いて可視化する試みを計画した。本年度は伸展刺激活性化イオンチャネルCIC-2とチャネルの伸展刺激修飾蛋白(新規蛋白)をクローニングしその分子構造を決定した。現在この抗体を作成し蛍光ラベルを試みている。今後は蛍光ラベルしたこれらの伸展刺激関連因子の伸展刺激に対する動態の可視化を行う。
培養DRG細胞の成長円錐に機械的刺激を与えると細胞体から内向き電流が記録され、約100-200msecの時間経過の速い型と、数秒間にわたって持続する遅い型の2種類があった。遅い型の逆転電位は-3.6±0.7mV(n=5)で、逆転電位の値は細胞外液中のクロライドイオン濃度に依存し、低濃度(11.7mM)のクロライド液中では逆転電位は54±5.1mV(n=5)に移動した。以上より、この内向き電流はクロライドチャネルの活性化によることが示唆された。
培養したラットDBB神経細胞の成長円錐の膜面上にラテックスビーズを付着させておき、50mWの赤レーザー光ピンセッによってこのビーズを掴んで移動させることができる。この時、細胞体を電気刺激して成長円錐から伝達物質であるアセチルコリンが放出されると、ビーズの移動が制限される。このことは成長円錐からの伝達物質放出に伴って細胞膜が接着性を増したためと思われた。
カバーガラス上に培養したラットの海馬神経細胞を全反射型の近接場光学顕微鏡で観察した。DiI蛍光は細胞体の一部と成長円錐に相当する部位でのみ検出され、これらの部位ではガラス面と細胞膜が200nm以下に接近していると推測された。また、成長円錐から伸展したフィロポディアの先端部も観察できたので、ガラス面に接近していることがわかった。今後この顕微鏡を用いて、細胞膜直下の機能性分子の存在とその機能、さらに細胞膜と支持体の間の接着構造の特性に関する研究を推進する。

研究成果

• [文献書誌] Soeda H, Tatsumi H, Katayama Y.: "Neurotransmitter release from growth cones of the dorsal root ganglion neurons in culture." Neuroscience. 77. 1187-1199 (1997)
• [文献書誌] Imai K, Tatsumi H, Katayama Y.: "Electrical responses of rat dorsal root ganglion cells in culture evoked by mechanical stimulation to growth cones." Neuroscience Research. Suppl 21. S93 (1997)
• [文献書誌] Tatsumi H, Sokabe M, Katayama Y.: "Observation of neuronal growth cones with evanscent light microscope." Neuroscience Research. Suppl 21. S142 (1997)
• [文献書誌] Soeda H, Tatsumi H, Katayama Y.: "Localization of Ca^<2+> channels involved in transmitter release in cultured neurons;immunocytological studies." Abstracts for Society for Neuroscience USA. 23. Part1-43 (1997)
• [文献書誌] Furukawa T, Ogura T, Katayama Y, Hiraoka M: "Characteristics of rabbit ClC-2 expressed in Xenopus oocytes and its contribution to volume regulation." American Journal of Physiology. (in press). (1998)
• [文献書誌] Katayama Y, Hirai K, Morita K.: "Concentration-dependent actions of a new indende derivative,TN-871,in the enteric nervous system." European Journal of Pharmacology. (in press). (1998)