カチオンアンチポーター作用制御の分子機構の研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07457015
• 研究機関: 国立循環器病センター
• 研究代表者: 重川 宗一 国立循環器病センター研究所, 循環分子生理部, 部長 (00113738)
• 研究分担者: 岩本 隆宏 国立循環器病センター研究所, 循環分子生理部, 室員 (20300973) ; 若林 繁夫 国立循環器病センター研究所, バイオサイエンス部, 室長 (70158583)
• キーワード: Na^+ / H^+交換輸送系 / Na^+ / Ca^<2+>交換輸送系 / カチオン交換輸送系

研究概要

本研究の目的は、細胞膜カチオン交換輸送に関わるNa^+/H^+並びにNa^+/Ca^<2+>交換輸送体分子の構造・機能相関並びに細胞内情報伝達系との相互作用を研究して、細胞生理及び病態におけるこれらの輸送系の役割を明らかにすることである。本年度は、これら輸送系の分子種の違いを利用したキメラ解析を主として行った。1)Na^+/H^+交換輸送系(NHE1)のautoinhibitoryドメインの作用機序を検討するため、このドメインへの種々のアミノ酸変異の導入、または、NHE2、NHE4及び機能的に類似した他のタンパク質のセグメントとの置換を行いその機能変化を検討した。また、このドメインとpHi-maintenanceドメインとの相互作用を調べるため、比較的相同性の高いNHE2、NHE4のそれぞれ対応するドメインと置換したキメラを作成し、ドメイン間の相互作用を解析した。2)CCL39等の繊維芽細胞、骨格筋細胞(L6)において、外液Na^+をNHE1の基質となるLi^+で置換するとpH_iが上昇することが見い出された。このpH_i上昇は、choline^+による置換やNHE1阻害剤(EIPA)存在下ではおこらず、また、NHE欠損株(PS120)ではおこらないことから、NHE1の活性化によると結論された。Na^+→Li^+置換によってCa^<2+>動員、PI代謝亢進は起こらない。また、Na^+→Li^+置換によるpH_iの上昇は、Gタンパク質(G_i,G_o)阻害剤IAP,MEK阻害剤PD98059,PI3kinase阻害剤LY294002によって阻害されず、PMA処理によりPKCを枯渇させてもほとんど阻害されないが、比較的低濃度のチロシンリン酸化阻害剤genisteinによって著明に抑制された。これらの結果は、細胞外に添加したイオンからNHE1活性化に至る新しいタイプの細胞内情報伝達機構が存在する可能性を示唆する。3)新しい阻害薬(KB-R7943)および2価カチオン(Ni^<2+>やCo^<2+>など)によるNa^+/Ca^<2+>交換輸送の阻害には分子種特異性があり、その阻害効果は前者の場合、NC×3>NC×2=NC×1であり、後者ではNC×2=NC×1≪NC×3であることが判明した。そこで、NC×1とNC×3のキメラを用いてこれらの阻害剤の作用部位と阻害機序を解析した。4)Na^+/Ca^<2+>交換輸送体(NC×1)をCCL39細胞に強制発現させたモデル細胞系を用いて、この輸送系がCa^<2+>ポンプに比べて約10倍Ca^<2+>親和性が低いにもかかわらず、アゴニストによる受容体刺激に際して細胞膜直下のCa^<2+>濃度上昇を阻止でき、Na^+/H^+交換輸送、Ca^<2+>依存性Kチャンネル及び細胞接着などCa^<2+>関連細膜機能の活性化を制御できることを示した。

研究成果

• [文献書誌] Ikeda,T.et al.: "Identification of Cytoplasmic subdomaists that control pH-sensing of the Na^+/H^+ exchanger(NHE1):pH-maintenance,ATP.sonsitive,and flexible loop domains" J.Biochem.(Tokyo). 121. 295-303 (1997)
• [文献書誌] Wakabayashi,S.et al.: "Molecular physiology of Vertebrate Na^+/H^+ exchangers" Physiol.Rev.77. 51-74 (1997)
• [文献書誌] Wakabayashi,S.et al.: "Calmodulin-binding autoinhibitory domain controls"pH-sensing"in the Na^+/H^+ exchange NHE1 through sequence-specific interaction" Biochemistry. 36. 12854-12861 (1997)
• [文献書誌] Uehara,A.et al.: "Whole-Cell Currents from acloned Canine Cardiac Na^+/Ca^<2+> exchanger NCX1 Cverexpressed in a fibrobrast cell CCL39." Pfliigers Arch.434. 335-338 (1997)
• [文献書誌] Iwamoto,T.et al.: "Na^+/Ca^<2+> exchanger overexpression impairs Calcium sigmaling in fibribrasts:Inhibition of〔Ca^<2+>〕rise at cell periphery and retardation of cell adhesion" Eur.J.Cell Biol. (in press).
• [文献書誌] Ikeda,T.et al.: "Overexpression of the Na^+/Ca^<2+> exchanger reveals a critical role of Ca^<2+> in growth factor-induced activation of the Na^+/H^+ exchanger(NHE1)" Am.J.Physiol. (in press).
• [文献書誌] Ikeda,T.et al: "Mechanism of inhibition of Na^+-H^+ exchanger(NHE1)by ATP depletion:Implications for myocordial ischemia" Kluwer Academic Publishers., 189-197 (1998)
• [文献書誌] Shigekawa,M.et al: "Regulatory mechanism of NHE1 isoform of Na^+/H^+ exchanger in carcliac and other tissues." Springer-Verlag,Tokyo(in press),