ピリドキサール酵素の触媒作用発現機構の解明をめざして

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07457031
• 研究機関: 大阪医科大学
• 研究代表者: 鏡山 博行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (80028555)
• キーワード: アスパラギン酸アミノ基転移酵素 / 芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素 / 分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素 / 芳香族アミノ酸脱炭酸酵素 / トリプトファナーゼ / ピリドキサル燐酸 / X線結晶解析 / 基質認識機構

研究概要

アスパラギン酸アミノ基転移酵素:(1)基質アスパラギン酸との反応の遷移相を種々のpHで観測し、従来から認められている基質結合過程の他に、速度論的に区別できないとされる、酵素と基質のプロトン化状態が逆のもう一つの過程も同時に生じていることを証明した。(2)DNAシャフリングによるランダム変異体作成により、本酵素を分岐鎖アミノ酸を認識できるように改変した。芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素:基質類似体共存下でのX線結晶解析を行い、芳香環とカルボキシル基という、全く性質の異なる基質側鎖の認識が、活性部位の複数の残基の側鎖のコンホメーション変化による水素結合網の組み換えでのみ行われていることを明らかにした。芳香族アミノ酸脱炭酸酵素:(1)Lys303が内シッフ塩基を形成する残基であることを示した。[Lys303Ala]酵素が行う副反応の解析から、このリシン残基は脱炭酸過程には関係せず、反応生成物の酵素からの遊離に働いていることを証明した。(2)Arg334でトリプトシンにより限定分解されるが、基質類似体で保護されること、また同部位周辺の化学修飾の速度も基質類似体で低下することから、触媒反応の進行に伴う同部位の構造変化を推定した。さらに、同部位で断片化された酵素を遺伝子操作で作製、野生型酵素と比較して、当部位の構造変化が外アルジミンの形成に重要な役を果たしていることを明らかにした。分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素:4-メチル吉草酸存在下でのX線結晶解析の結果、基質が結合すると大小ドメインを結ぶループの動きで活性中心を溶媒から遮閉すること、ならびに基質の側鎖とα-カルボキシル基の認識機構が明らかになった。トリプトファナーゼ:ピリドキサールの内シッフ塩基は、活性を発現する弱塩基領域では不活性な置換型アルダミン構造であるが、基質の結合によって活性なケトエナミン構造へと変化することを、反応速度論的に証明した。

研究成果

• [文献書誌] Oue,S.: "Paracoccus denitrificans aromatic amino acid aminotransferase: A model enzyme for the study of dual substrate recognition mechanism" Journal of Biochemistry. 121,1. 161-171 (1997)
• [文献書誌] Mollova,E.T.: "Use of 1H-15N heteronuclear multiple-quantum coherence NMR spectroscopy to study the active site of aspartate aminotransferase" Biochemistry. 36. 615-625 (1997)
• [文献書誌] Nishino,J.: "An anomalous side reaction of the Lys303 mutant aromatic-L-amino acid decarboxylase unravels the role of the residue in catalysis" Journal of Biochemistry. 121,3. 604-611 (1997)
• [文献書誌] Okada,K.: "Three-dimensional structure of Escherichia coli branched-chain amino acid aminotransferase at 2.5Å resolution" Journal of Biochemistry. 121. 637-641 (1997)
• [文献書誌] Hayashi,H.: "Transient-state kinetics of the reaction of aspartate aminotransferase with aspartate at low pH reveals dual routes in the enzyme-substrate association process." Biochemistry. 36,44. 13558-13569 (1997)