ミオシン結合型プロテインホスファターゼの心血管系における機能とその異常

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07457168
• 研究種目: 一般研究(B)
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 中野 赳 三重大学, 医学部, 教授 (60111879)
• 研究分担者: 伊藤 正明 三重大学, 医学部, 助手 (00223181)
• キーワード: 平滑筋 / ミオシンリン酸化 / ミオシンホルファラーゼ

研究概要

ミシオン結合型プロテインホスファターゼ(MBP)の心血管系における機能ならびに各種病態との関係を解明するために本年度は以下の項目につき検討を行なった
1.ミオシン結合型プロテインホスファターゼ(MBP)の生化学的性状解析
精製MBPに、MBPの130kD(M130)を燐酸化しミオシンホスファターゼ活性を阻害させるキナーゼが混在していることが明らかになった。さらに、低分子量G蛋白質Rhoのアフィニティーカラムにより、M130がGTP依存性にRhoAに結合し、さらにRhoキナーゼにより燐酸化されることも判明した。また、MBPがPSPAやPIなどのリン脂質と結合しホスファターゼ活性の低下が引き起こされ、AキナーゼによるMBPの燐酸化はこの結合ならびにホスファターゼ活性の低下を阻害した。
2.ヒトのミオシン結合型ホスファターゼ(MBP)のアミノ酸一次構造解析
ニワトリ砂嚢平滑筋M130のcDNAをプローベに、ヒト肺cDNAライブラリーをスクリーニングし、ヒトMBPのcDNAのクローニングを行った。現在解析されているシークエンスはニワトリM130のAla^<168>よりC末端までの863アミノ酸で、ニワトリならびにラットそれぞれ82、87%の高いホモロジーを有している。来年度も引き続きクローニングを行い、N端に相当するcDNAをクローニング・シークエンスし全アミノ酸配列を決定したいと考えている。
3.MBPの各サブユニットに対する抗体の作成
MBPはM130、触媒サブユニット(PPlc)ならびに20kDサブユニット(M20)で構成されている。M130に対する抗体は、N端2/3のリコンビナントを、M20に対する抗体はリコンビナントおよびC端のペプチドを抗原として、さらにPPlcの抗体はPPlcのC端のペプチドを抗原として、ウサギに免疫し、抗血清を得、それぞれのアフィニティーカラムにて抗体を精製した。これらの抗体を用いて、来年度の予定しているMBPの局在の検討などを行う予定である。

研究成果

• [文献書誌] Takeshi Matui: "Rho‐associated kinase,a hovel serine/threonine kinose, as a putaive target for the small GTP‐binding protein Rho" The EMBO Journal. in press (1996)
• [文献書誌] Katsuya Hirano: "Interaction of the ribosonal protein, LS, with proteinphosphatase type1." Journal of Biological Chemistry. 270. 19786-19790 (1995)
• [文献書誌] Kazuhito Ichikawa: "Phosphorylafion of the large subunito of myosin phosphatase and inhibitton of phosphatase activity" Journal of Biological Chemistry. in press (1996)
• [文献書誌] Masatoshi Miyahara: "Isoenzymes of cyclic nucleotide phosphodiesterase in the human aorta: charactorization and the effects of E4021" European Journal of Pharmacology. 284. 25-33 (1995)
• [文献書誌] Masaaki Ito: "Regulation of the Contractile Cycle in Smooth Muscle" Takeshi Nakano and David J. Harishorne. eds. Splirger‐Verlog, Tokyo, 239(187-200) (1995)
• [文献書誌] Satoshi Matsushima: "Requlatior of the Contrachile Cycle in Smooth Muscle" Takeshi Nakano and David J. Harishone eds. Splinger‐Verlog, Tokyo, 239(131-137) (1995)