in situ PCR法による気管支原発早期肺癌発生過程の遺伝子異常の多角的評価

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07457286
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 佐藤 雅美 東北大学, 加齢医学研究所, 助手 (30250830)
• キーワード: in situ PCR / K-RAS / 点突然変異 / PCR / in situ hybridization / direct in situ PCR

研究概要

微小な病変での遺伝子変異の有無は、これまでmicrodissectionとPCRによって検討されてきたが,細胞単位での変異の有無を知ることは不可能であった.細胞単位での遺伝子変異をin situで観察することが可能となれば,癌の発生における遺伝子変化と組織形態学的変化に関して極めて重要な知見が得られるであろう.最近開発されたin situ PCRは,PCRとin situ hybridizationを組み合わせた手法で,単一または少ないコピー数の遺伝子のin situでの検出に期待がもたれている.
昨年度までの研究で,我々は細胞株を用いて単個の細胞内でのK-rasコドン12の変異をin situ PCRを用いて検出することに成功した.本年はさらに応用可能な条件を検討し,細胞浮遊液を用いた実験系で,95%エタノル固定16時間,0.1-1.0μg/dlプロテイナーゼK処理37度15分,40サイクルのPCR,10%緩衝ホルマリンによる後固定16時間,in situ hybridization後の厳密なwashingにより,細胞株Calu-l(K-rasコドン12変異株),H460(野生株)はそれぞれ望ましい染色を得,各コントロールも適切な染色を得ることに成功した.一方,プローブを用いないdirect in situ PCRは,操作が簡便で迅速な処理が可能であるが,非特異的染色が強くシグナルは検出不能であった.本年は制限酵素とDNA分解酵素を用いて,非特異的染色の本態を明らかにすると共に,direct in situ PCRを用いた検出には限界があり,点突然変異の検出は困難であることを明らかにした.

研究成果

• [文献書誌] Sato, et al.: "Sequential loss of heterozygosity in the progression of squamous cell carcinoma of the lung." British Journal of Cancer. (in press). (1998)
• [文献書誌] Sagawa, et al.: "K-ras point mutation occursin the early stage of carcinogenesis in lung canser" British Journal of Cancer. 77(5). 720-723 (1997)
• [文献書誌] Sagawa, et al.: "Detection of K-ras point mutation by in situ PCR in cell suspensions." Lung Cancer. 17. 181-195 (1997)
• [文献書誌] Sato, et al.: "PTEN1 is frequently mutated in primary endometrial carcinomas." Nature Genetics. 17. 143-144 (1997)