myc系oncogene産生蛋白の定量的測定法の確立とその臨床的意義の評価

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07457420
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 上井 義之 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (70177567)
• 研究分担者: 逸見 仁道 東邦大学, 医学部, 助教授 (90165514) ; 尾花 和子 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (60272580) ; 土田 嘉昭 群馬県立小児医療センター, 院長 (80010164)
• キーワード: 神経芽細胞腫 / N-Myc蛋白 / ELISA / MAP法 / recombinant N-Myc

研究概要

研究実績報告書
神経芽細胞腫のがん遺伝子であるN-mycの異常発現を、その産物であるN-Myc蛋白を定量することにより知ることは極めて重要なことである。平成8年度、サンドウィッチ型ELISA.法の確立を目標として、以下の研究を行った。
N-Myc蛋白全体の中から本蛋白に特異的と考えられる17個のアミノ酸(codon223-239,GVAPPRPGGRQTSGGDH)、及び、16個のアミノ酸(codon136-151,HGRGPPTAGSTAQSPG)の2種のペプチドを選び、これらを人為的に合成せしめ、家兎を用いてポリクローナル抗体を得、これらより抗N-Myc蛋白特異IgGを精製する実験を行った。multiple antigen peptide(MAP)法により、上記の2種のペプチドにより家兎にポリクローナル抗体を生成せしめたところ、codon223-239の17個のアミノ酸(GVAPPRPGGRQTSGGDH)からなるペプチドより、特異性が高く、抗体価の非常に高い抗体が得られ、アフィニティカラムによりこれを抗N-Myc蛋白特異IgGにまで精製することができた。
次いで、N-myc DNA sequenceのうち、exon2とexon3から一定の長さのDNAをクローンし、発現ベクターpET16bに挿入、大腸菌によりrecombinant N-Myc蛋白を得た。そして、本recombinant N-Myc蛋白は、大きさが38kDaであり、本来のN-Myc蛋白(62kDaと64kDaのdoublet)よりもやや小さいが、水に溶解するものであることが確認された。腫瘍組織から得られる通常のN-Myc蛋白は水に難溶性であるので、水溶性にして大きさが本来のN-Myc蛋白とあまり変わらないものが得られたことは、本蛋白に対するELISA法開発にむけて、一つのbreak-throughとなるものと評価される。

研究成果

• [文献書誌] Y.Tsuchida,Y.Kamii,et al.: "Effects of Poclitaxel,Fotemustine Irinotecan,Mitomycin C Ifosfamide and Blesmycin on a highly melignant xeno-transplanted" Cancer Journal. 9(6). 323-328 (1996)
• [文献書誌] Y.Tsuchida,et al.: "Genetic clinical markers of human neuroblastoma with special reference to N-myc on cogene" Tumor Biology. 17(2). 65-74 (1996)
• [文献書誌] H.Henmi,Y.Tsuchida,et al.: "Competitive polymerase chain reaction for the quantification of N-myc gene copy number in neuroblastoma" Tumor Biology. 17(5). 262-270 (1996)
• [文献書誌] 土田嘉昭,他: "神経芽腫と癌遺伝子" 医学と薬学. 37(3)(in press). (1997)
• [文献書誌] Y.Kamii,Y.Tsuchida,et al.: "Effects of CPT-II on a human shabdomyosarcoma in nude mice and in culture." International Journal of Pediatric Hematology and Oncology. 3(4). 201-205 (1996)