シトクロムP450cam反応における酸素活性化機構

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07458163
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 石村 巽 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40025599)
• 研究分担者: 永野 真吾 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (60286440) ; 広瀬 忠明 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (60051405) ; 江川 毅 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10232935) ; 島田 秀夫 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (80095611)
• キーワード: シトクロムP450 / P450cam / 酸素活性化 / 酸触媒 / Site-directed mutagenesis / O-O結合開裂反応 / 人工アミノ酸 / スレオニン

研究概要

X-線結晶解析によりその構造が明らかにされている緑膿菌由来のチトクロームP450cam(P450cam)をモデル系として用い、ヘム含有モノオキシゲナーゼであるチトクロームP450による酸素(O_2)の活性化機構を追求した。P450camはカンファー水酸化酵素系の末端モノオキシゲナーゼであり、下記の反応を触媒する。
d-camphor+NADH+O_2+H^+→5-exo-hydroxycampor+NAD^++H_2O
先に我々はP450camの酸素活性化部位に位置するThr252を水酸基をもたない他のアミノ酸残基で置換すると、活性部位に結合した酸素(O_2)は2電子還元されてもそのO-O結合が開裂されず、過酸化水素(H_2O_2)として放出されることを見い出した。すなわちThrの水酸基がO-O結合開裂の酸触媒として働く可能性が示唆された。この仮説の是非を検証するため、昨年に引き続き今年度も、Thrの位置にO-methyl-Thr、O-methyl-Asp、3-amino-Ala等の人工アミノ酸を部位特異的に導入し、得られた酵素の諸性質を解析した。その結果、252-Thrの水酸基(-OH)は酸触媒として作用するのではなく、その酸素原子(O)が水分子(H-O-H)の水素原子と水素結合することにより、上記の反応に必須なプロトンリレー系を正しく保持するものであることが示唆された。換言すると、モノオキシゲナーゼ反応を可能とする酸素活性化、すなわちO-O結合の開裂が高能率に起こるためには、供給されるプロトンが、ヘム鉄に結合した酸素分子(Fe-O-O)に一定の方向から一定の部位目指して接近することが必要であり、252-Thrの酸素原子(O)はプロトンリレー系を正しい位置に保持する役目を果たすものと思われる。

研究成果

• [文献書誌] Yamaguchi,T.,Ishimura,Y.他6名: "Taurocholate induces directional excretion of bilirubin into bile in perfused rat liver" Am.J.Physiol. 270. G1028-1032 (1996)
• [文献書誌] Unno,M.Ishimura,Y 他3名: "Role of Arg112 of cytochrome P450cam in the electron transfer from reduced putidaredoxin" J.Biol.Chem. 271. 17869-17874 (1996)
• [文献書誌] Suematsu,M.,Ishimura,Y.他1名: "Gaseous monoxides:a new class of microvascular regulator in the liver" Cardiovascular Research. 352. 679-686 (1996)
• [文献書誌] Goda,N.,Ishimura.Y.他5名: "Modulation of mitochondrion-mediated oxidative stress by nitric oxide" Am.J.Physiol. 271. H1893-H1899 (1996)
• [文献書誌] Suematsu,M.,Ishimura,Y.他5名: "Toxic Waste or Hormone?Carbon Monoxide as a Regulator of Ainusoidal Tone" Hepatology. 24. 1319-1321 (1996)
• [文献書誌] Mitani,F.,Ishimura,Y.他3名: "Expression of cytochromes P450aldo and P45011 in rat adrenal gland" Steroids. 62. 57-61 (1997)
• [文献書誌] Shimada,H.et al.: "Oxygenases and Model Systems:Heme Monooxygenases" Kluwer Academic Publishers(Editor,T.Funabiki), 195-211 (1997)