| 研究概要 |
平成7年度の課題として、1)RPB5とHBxによる転写開始基本因子TFIIBとの結合の解析、2)変異RPB5を作成して、RPB5の2量体化とX蛋白との結合の2つの機能に関わる必須領域の解析、3)RPB5と相互作用する蛋白の検索、を検討して、以下の実績を得た。
1)RPB5とX蛋白(HBx)との特異的結合をin vitroで確認し、RPB5が1000Kd以上に分布する分画に検出され、HBxとの結合を見いだし報告した(EMBOJ.,1995)。RPB5と転写開始因子との相互作用を検討し、TFIIBが特異的にhRPB5と結合することを見いだした。同時にHBxとTFIIBとの結合性を確認し、3者の各種欠損変換組み換え蛋白による解析から、3者が異なった結合領域を介して3者が相互作用するモデルを想定した。これを支持する結果として、トランス活性化能の低下したアミノ酸置換変異HBxでhPRB5とTFIIBの結合性のいずれかのみが欠損する変異領域を同定し、またin vivoの強制発現系で3者の複合体形成を示す予備的結果を得た(投稿中)。2)各種変異RPB5を用いてRPB5の2量体化領域の同定を行い、hPRB5の中央部よりC端部分の2量体化領域を決定した。この領域はHBx結合領域と異なった領域であった。またパン酵母及び分裂酵母のRPB5を用いた2量体化の互換性の検討を行った。3)hRPB5に結合する蛋白因子cDNAのクローニングをfar-Western法で検討し、幾つかの候補を選択した。クローンの構造決定とXトランス活性化に対する影響を測定した結果、Xの機能に拮抗する作用を持つ蛋白の新規遺伝子のcDNAを単離した。4)HAエピトープ標識hRPB5のほ乳細胞発現プラスミドを構築し、ヒト培養細胞系に導入しstable transfectantのクローンを薬剤耐性で選択し、高発現細胞株の樹立を行っている。
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