短時間前脳虚血に伴う海馬CA1錐体細胞のアポトーシスとその回避

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07458201
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 内山 安男 大阪大学, 医学部, 教授 (10049091)
• 研究分担者: 大沢 良之 大阪大学, 医学部, 助手 (30273642) ; 和栗 聡 大阪大学, 医学部, 助手 (30244908) ; 後藤 隆洋 大阪大学, 医学部, 講師 (20135693) ; 渡部 剛 大阪大学, 医学部, 助教授 (80220903)
• キーワード: bcl-2 / アポトーシス / PC12細胞 / 遺伝子導入 / cDNAクローニング / 神経栄養因子

研究概要

本研究では、私達がこれまでに明かにした、bcl-2遺伝子導入PC12細胞(PC-bcl)が分泌するアポトーシス回避因子を解析した。PC-bcl細胞の無血清培養上清を濾過濃縮器で100倍に濃縮後、分子量50kD以上3kD以下をカットし逆相HPLCで展開した。得られた分画を野生型PC12(wtPC12)細胞を無血清条件下での培養に添加し、生存率を検討した。生存活性のある分画を、native PAGEで展開し、切り出した分画から夫々蛋白を抽出し、生存活性を検討した。得られた分画をSDSPAGEで展開すると35kDの蛋白の存在が確かめられた。この蛋白分子を同様の手法で精製した後、シクエンサーでアミノ酸配列を検討した。その結果、35kDの蛋白でN端から22アミノ酸残の配列を決定出来た。このアミノ酸配列をもつ蛋白をデータベースで検索したところ全く新たな蛋白であることがわかった。そこで、ブロムシアンで処理して蛋白分子のフラグメントを作製し、同様の方法でN端のアミノ酸配列を決定した。両者からオリゴ-プローブを作製し、PCR法によりPC12細胞から得られるcDNAのフラグメントを検索した結果、390bpの核酸配列を決定できた。現在、本蛋白のcDNA全構造を解析中である。また、N末端から12アミノ酸残基に相当するペプチドを合成し、ポリクローナル抗体を作製した。本抗体を用いて精製過程の分画をイノムブロットすると、35kD蛋白を認識する。さらに、NGF処理したPC-bcl細胞を免疫染色すると突起の先端部に強く陽性反応が見られた。また、ラットの胎仔および生後5日の脳で免疫染色したところ、胎仔では神経細胞に強い陽性反応が見られた。
本蛋白がwtPC12細胞を無血清条件下で培養した時の、生存維持活性をNGFと比較すると、本蛋白110pMがNGF10pMに相当することがわかった。native PAGEから抽出するために、活性が減少していることを考慮すると通常の生理活性の濃度でも十分活性があると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Shimizu,S.,Eguchi,Y.,Kamiike,W.,Waguri,S.,Uchiyama,Y.,Matsuda,H.,Tsujimoto,Y.: "Retardation of chemical hypoxia-induced necrotic cell death by Bcl-2 and ICE inhibitors : possible involvement of common mediators in apoptotic and necrotic signal transduction." Oncogene. 12. 2045-2050 (1996)
• [文献書誌] Shimizu,S.,Eguchi,Y.,Kamiike,W.,Waguri,S.,Uchiyama,Y.,Matsuda,H.,Tsujimoto,Y.: "Bcl-2 blocks loss of mitochondrial membrane potential while ICE inhibitors act at a different step during inhibition of death induced by respiratory chain inhibitors." Oncogene. 13. 21-29 (1996)
• [文献書誌] Kubo,T.,Enokido,Y.,Yamada,M.,Oka,T.,Uchiyama,Y.,Hatanaka,H.: "Oxygen-induced apoptosis in PC-12 cells with special reference to the role of Bcl-2." Brain Research. 733. 175-183 (1996)
• [文献書誌] Satoh,T.,Sakai,N.,Enokido,Y.,Uchiyama,Y.,Hatanaka,H.: "Survival factor-insensitive generation of reactive oxygen species induced by serum deprivation in neuronal cells." Brain Research. 733. 9-14 (1996)
• [文献書誌] Gotow,T.,Sakata,M.,Funakoshi,T.,Uchiyama,Y.: "Preferential localization of annexin V to the axon terminal." Neuroscience. 75. 507-521 (1996)
• [文献書誌] Satoh,T.,Sakai,N.,Enokido,Y.,Uchiyama,Y.,Hatanaka,H.: "Free radical-independent protection by nerve growth factor and Bcl-2 of PC12 cells from hydrogen peroxide-triggered apoptosis." J.Biochem.120. 540-546 (1996)
• [文献書誌] Enokido,Y.,Kubo,T.,Satoh,N.,Uchiyama,Y.,Hatanaka,H.: "Biochemical characteristics of oxygen-induced and low K^+ medium-induced apoptotic neuronal death.In : Neurodegenerative disease.ed.Fiskum,G." Plenum Press,New York, 435-437分担