| 研究課題/領域番号 |
07458212
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
SAFFEN DAVID 東京大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (50231329)
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| 研究分担者 |
小幡 邦彦 岡崎国立究機構, 理研・神経部門, 教授 (60013976)
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| キーワード | キメラマウス / 遺伝子発現 / zif268 / βガラクトシダーゼ / ルシフェラーゼ / 相同組み替え / PCR / ターゲッティングベクター |
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| 研究概要 |
我々は、マウスのzif268遺伝子をβ-ガラクトシターゼレポーター遺伝子に変えるターゲッティングベクターの構築とテストを終了した。このターゲッティングベクターをPC12D細胞に恒常的に導入したところ、zif268遺伝子を発現する試薬の添加によって、β-ガラクトシダーゼ活性の顕著な上昇が見られた。次に、このターゲッティングベクターをTT2マウス胎児幹細胞に導入し、ネオマイシン耐性を持つコロニーを100個単離した。これらのコロニーから、染色体DNAを抽出し、相同組み替えを起こしたDNA断片のみを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR解析を行ったところ、ターゲッティングベクターが、内在のzif268遺伝子の位置に挿入されたCell lineが3つ得られた。現在、この細胞を用いてキメラマウスの作成を行っている。また我々は、β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子をPC12D細胞に恒常的、あるいは一時的に導入し、その発現を調べる実験を行った。昨年、我々は、その予備実験の結果報告の中で、真のzif268遺伝子の発現誘導の観察には、レポーター遺伝子の発現ベクターが染色体に挿入されることが必要であることを示唆するデータが得られたとしていたが、今回の実験により、レポーター遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼを持つ発現ベクターは、一時的な導入によってもzif268遺伝子の発現誘導を正しく表すことがわかった。一方、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを持つ発現ベクターは、その導入が一時的であるか恒常的であるかにかかわらず、NGF刺激に対しては顕著な応答を示すが、カルバコールやホルボールエステル、サプシガルギン、フォルスコリンなどの内在のzif268遺伝子の発現を誘導する他の試薬に対する応答は非常に弱いということがわかった。
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