| 研究課題/領域番号 |
07458222
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
大槻 磐男 九州大学, 医学部, 教授 (70009992)
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| 研究分担者 |
弥永 富美 九州大学, 医学部, 助手 (50274436)
森本 幸生 九州大学, 医学部, 助手 (50202362)
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| キーワード | 筋収縮 / Ca感受性 / アシドーシス / トロポニン / pH感受性 |
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| 研究概要 |
平成7年度は、当初の研究実施計画に沿って以下のように研究を行った。
1.収縮モデルの作成及びpH変動による筋収縮Ca感受性変化の測定
速筋としてウサギ腸腰筋と背筋、遅筋としてひらめ筋、心筋として左心室肉柱をもちいた。標本作成に関しては、当初予定していたTriton X-100処理後50%グリセリン中にて-20℃で保存し使用するという方法はとりやめ、それぞれを毎回0.5%のBrij-58にて30分処理することにより作成した新鮮なスキンドファイバーを用いて実験を行った。pH低下による張力発生のCa感受性の低下の大きさ、すなわちpH感受性は心筋が最も大きく、従来の報告に一致していた。どのpHにおいても遅筋は速筋に比べ明らかに高いCa感受性を示したが、速筋と遅筋のpH感受性の間には従来いわれているような差は認められずほぼ同じpH感受性を示すことが明らかになった。
2.トロポニンサブユニットのcDNAクローニングおよび大腸菌における発現
骨格筋速筋・遅筋および心筋のトロポニンサブユニットは計9種存在するがこのうちすでにcDNAの配列が明かにされている6種類については、PCR法を用いてクローニングを行った。cDNAの配列からそれぞれのトロポニンサブユニットに特異的なプライマーを合成し、それらのプライマーによりライブラリーからPCRによって増幅させたPCR産物を得、これらをクローニングベクターpucl18また119に組み込みシークエンスを行った。また現在までにcDNAの配列が明かにされていない3種類については該当する筋肉からmRNAを抽出し、ライブラリーを作製してクローニングを行っている。
cDNAのクローニングに成功したトロポニンサブユニットについては、発現用ベクターpET3d、pMal-c2またはptrc99Cに組み込みタンパク質の発現実験を行った。発現量、精製の難易度などを検討し組み込むベクターを決定した後、リットル単位での発現および精製を現在行っており、同時に、他のサブユニットとの結合能などの基本的な性格を検討している。
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