ステロイドレセプターの多様性と脳の分化機構の解析

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07458257
• 研究種目: 一般研究(B)
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 河田 光博 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (60112512)
• 研究分担者: 横山 佳子 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (70264752) ; 森田 規之 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (50239662) ; 小澤 一史 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (60169290)
• キーワード: ステロイドホルモン / ステロイドホルモンレセプター / 脳 / 特異抗体 / 免疫組織化学法 / in situハイブリダイゼーション / 組織分化 / ラット

研究概要

ステロイドホルモンレセプター各ドメインに対するポリクローナル抗体の作成:エストロゲン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイドレセプターのcDNAを制限酵素によってホルモン結合ドメイン、DNA結合ドメイン、全長の異なる組み合わせのDNAフラグメントに分け、グルタチオンSトランスフェラーゼとの融合蛋白を発現させ、pGEX-3Xプラスミッド内に、平滑末端結合により挿入した組換えベクターを用意した。できたプラスミッドを大腸菌にトランスフォームさせ、増殖させたのち融合蛋白を可溶化し、精製した。ファクターXによって目的とする蛋白を単離、精製ののちアジュバントを作り、ウサギを免疫した。抗体の力価検定にはウエスターンブロットやELISAで行い、アフィニティカラムで抗体の精製を行った。
ステロイドホルモンレセプタープローブの作成:制限酵素で切り出したcDNAのフラグメントをプラスミッドpGEM-4のマルチクローニングサイトに組み込ませ、大腸菌にトランスフォームさせたのち、直鎖化し、SP6RNAポリメラーゼまたはT7RNAポリメラーゼによるインビトロトランスクリプション法により、ジゴキシゲニン標識RNAプローブを作成した。また、それぞれのドメインに特異的塩基配列をコンピュータ検索で明らかにし、DNA合成装置を用い、それらの領域に対するオリゴヌクレオチドプローブを作成、同様にジゴキシゲニン標識プローブを作成した。
免疫細胞化学法、in situハイブリダイゼーション法による組織化学的検索:これらの抗体やプローブを用いて免疫細胞化学法、in situハイブリダイゼーション法によって、ラット胎性期、新生時期、成熟時での脳組織を検索し、どの時期のどの部位にどのようなステロイドホルモンレセプター蛋白ならびにmRNAが発現しているのか詳細に観察した。この所見をもとに、視床下部、海馬、小脳、大脳皮質における細胞死をニッスル染色、TUNEL法によって確認し、レセプター蛋白の発現との相関性を解析した。

研究成果

• [文献書誌] Morimoto,M.,Morita,N.and Kawata,M.: "The effects of NGF and glucocorticoid on the cytological features of rat chromaffin cells in vitro." NeuroReport. 5. 945-956 (1994)
• [文献書誌] Kawata,M.,Yuri,K.and Morimoto,M.: "Steroid hormone effects on gene expression,neuronal structure and differentiation." Hormones and Behavior. 28. 477-482 (1994)
• [文献書誌] Nishi,M.,Ueda,S.,Morita,N.and Kawata,M.: "Effects of glucocorticoid on neurones of rat dentate gyrus in dissociated culture." NeuroReport. 5. 2446-2448 (1994)
• [文献書誌] Nishimura,A.,Ueda,S.,Takeuchi,Y.,Sawada,T.and Kawata,M.: "Age-related decrease of serotonergic fibres and S-100β immunoreactivity in the rat dentate gyrus." NeuroReport. 6. 1317-1320 (1995)
• [文献書誌] Kawata,M.: "Roles of steroid hormones and their receptors in structural organization in the nervous system." Nourosci.Res.24. 1-46 (1995)
• [文献書誌] Pasterkamp,R.J.,Yuri,K.,Visser,D.T.M.,Hayashi,S.and Kawata,M.: "The perinatal ontogeny of estrogen receptor-immunoreactivity in the developing male and female rat hypothalamus." Dev.Brain Res.,. (in press).